張 迪,靳國忠,王 霄,韓 超,吳占軍,史萬玉,2

(1.河北農業(yè)大學中獸醫(yī)學院，河北保定 071000;2.河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心,河北保定 071000；3.河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050035)

牛奶作為人類日常生活中的必需品，而奶牛乳房炎對奶牛養(yǎng)殖業(yè)來說是非常嚴重的疾病，奶牛一旦發(fā)生乳房炎，牛奶品質必將受到影響，產奶量也會降低[1]，嚴重的會引發(fā)敗血癥，導致死亡[2]。引起奶牛乳房炎的病原菌主要為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希氏菌以及鏈球菌，而金黃色葡萄球菌性乳房炎是其中最常見的病原菌[3]。金黃色葡萄球菌感染的乳房炎類型多為隱性或慢性感染，它可以進入乳腺上皮細胞以及巨噬細胞內生存，從而使抗菌藥物很難發(fā)揮作用[4]。以奶牛作為試驗動物成本高，且不易操作，自從20世紀70年代Chandler成功建立了小鼠乳腺炎模型后[5]，成為眾多科研人員進行疫苗研發(fā)及藥物治療的不二之選，但小鼠乳腺炎必須借助體式顯微鏡才能觀察到乳導管[6]，操作要求較高，而大鼠乳腺不需要放大也可以看到，相比小鼠更加方便，建立大鼠乳腺炎模型，反映機體的炎癥水平，為奶牛乳房炎的體內機制研究、藥物治療效果評價，提供可靠的乳腺炎模型成為一種趨勢[7]。為此，本試驗采用臨床患有乳房炎的奶牛乳汁中分離純化得到的金黃色葡萄球菌感染大鼠乳腺從而建立大鼠乳腺炎模型，為后續(xù)乳房炎研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和菌種 健康SPF級Wistar大鼠，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[實驗動物許可證號SCXK(京)2019-0010]；金黃色葡萄球菌分離自臨床乳房炎病例，由河北農業(yè)大學預防獸醫(yī)實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 LB肉湯、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司產品；Rat TNF-α ELISA試劑盒、Rat IL-1β ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產品；Rat IL-6 ELISA試劑盒，R&D SYSTEMS產品；組織蛋白抽提試劑盒，康為世紀生物科技有限公司產品；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液，北京博邁德生物技術有限公司產品；蛋白Marker、GAPDH抗體，北京全式金生物技術有限公司產品；BCIP/NBT顯色液，北京百智生物科技有限公司產品；TLR2抗體、p-p65 抗體，北京博奧森生物技術有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 獸用全自動血液細胞分析儀(BC-2800Vet)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產品；生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)，上海博訊實業(yè)有限公司產品；臺式恒溫振蕩器(TH2-3-20)，上海精宏實驗設備有限公司產品；組織勻漿機(T10BS25)，艾卡(廣州)儀器設備有限公司產品；高速低溫離心機(CT14RD)，上海天美生化儀器設備工程有限公司產品；電泳儀(DYCZ-24DN)、轉膜儀(DYCZ-40D)、電泳儀電源(DYY-8C)，北京六一生物科技有限公司產品；組織包埋機(KD-BM Ⅲ)、切片機(KD-2508)，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 SPF大鼠54只，18只公鼠，36只母鼠，先適應1周，隨后公母1∶2合籠，觀察陰栓辨別是否懷孕，懷孕后將母鼠分籠飼養(yǎng)。將泌乳至第7天的健康母鼠36只隨機分為C、M1、M2、M3、M4、M5共6組,每組6只。C組:生理鹽水組,每只母鼠第4對乳腺每側注射0.1 mL無菌生理鹽水;M1、M2、M3、M4、M5組:每只母鼠第4對乳腺每側分別注射0.1 mL含金黃色葡萄球菌2×105、2×106、2×107、2×108、2×109CFU/mL的細菌懸液。具體操作為取泌乳第7天的母鼠于接菌前2 h使其與仔鼠分離，用乙醚麻醉后固定母鼠。大鼠第4對乳腺用750 mL/L酒精消毒皮膚，然后用小鑷子輕輕夾起乳頭，用100 μL微量注射器沿乳頭管插入，大約插入2 mm～3 mm，保持注射器不動，緩慢注入菌液。

1.2.2 大鼠臨床表現(xiàn)及眼觀病理變化 觀察并記錄大鼠飲食飲水情況、精神狀況、有無死亡等表現(xiàn)，以及處死后乳腺病理變化。

1.2.3 乳腺組織HE染色 注菌后24 h用乙醚麻醉大鼠，脫椎處死，剪開腹部皮膚但不剪開腹腔，用手術刀和鑷子輕輕分離第4對乳腺，一側乳腺放入中性福爾馬林溶液中固定，隨后進行HE染色，觀察組織病理變化。

1.2.4 乳腺組織細菌計數(shù) 取另一側部分乳腺按照1 mL∶100 mg的比例加入生理鹽水后使用勻漿器勻漿，取勻漿液100 μL采用平板計數(shù)法測定乳腺組織內的細菌數(shù)量。

1.2.5 血常規(guī)檢查 將感染24 h的大鼠乙醚麻醉后，左手固定母鼠，右手持10 mL注射器進行心臟采血，將血液打入抗凝管，立即用血細胞分析儀進行血細胞分析。

1.2.6 乳腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量測定 采集乳腺組織，稱取0.1 g加入900 μL的磷酸鹽緩沖鹽溶液，用勻漿器充分勻漿，勻漿過程在冰盒上進行，之后使用4°C離心機2 500 r/min離心20 min，收集上清進行白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素6(interleukin- 6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量測定。

1.2.7 乳腺組織中TLR2、p-p65蛋白表達的測定

將Tissue protein extraction reagent與Protease inhibitor cocktail 、Phosphatase inhibitors按98∶1∶1的比例配置蛋白提取液，稱取0.1 g乳腺組織加入1 mL蛋白提取液，使用BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度并調整至同一濃度，Western blot檢測各組乳腺組織中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)、磷酸化的核因子κB(p-NFκB，p-p65)蛋白含量，結果使用Image J圖像分析軟件測量灰度值，以目的蛋白條帶與內參條帶的灰度值比值表示其相對含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 19.0分析軟件(IBM Corporation，Armonk，NY，USA)對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性水平為P<0.05或P<0.01。

2 結果

2.1 臨床表現(xiàn)及乳腺眼觀病變

C組空白對照未出現(xiàn)任何臨床癥狀；M1和M2組大鼠飲水采食輕微減少，活動量相比空白組減少，精神輕度沉郁；M3及M4組大鼠飲食和飲水量明顯減少，精神沉郁，被毛粗糙，蜷縮弓背，偶見腹瀉；M5組大鼠被毛粗糙無光澤，蜷縮在一角，精神萎靡，用手觸碰反應慢，死亡2只。剖開腹部皮膚后觀察乳腺組織，C組乳腺呈粉白色，無出血，有光澤；M1組乳腺組織出血較輕微，有光澤；M2組乳腺彌散出血，體積較正常組織增大，顏色發(fā)暗；M3組乳腺組織相比空白組粗糙，有明顯出血點，體積縮小，無光澤；M4組乳腺組織可見明顯大量彌散性出血點，血管增多，顏色明顯發(fā)暗，體積縮??；M5組乳腺組織出血和淤血嚴重，組織化膿，顏色暗沉，體積顯著縮小，組織損傷嚴重(圖1)。

C.空白對照組；M1.2×105CFU/mL；M2.2×106CFU/mL；M3.2×107CFU/mL；M4.2×108CFU/mL；M5.2×109 CFU/mL

2.2 乳腺組織病理組織切片

C組乳腺組織結構清晰，乳腺腺泡結構完整，各個小葉之間的間隙小，腺泡腔飽滿且乳汁充盈，扁平狀的乳腺上皮細胞細胞核染色呈藍色，依次排列在腺泡外側；M1組乳腺小葉結構清晰，小葉間隙相比C組有所增寬，個別上皮細胞脫落進入腺泡內；M2組偶見粉色滲出，腺泡之間界限略微增寬，腺泡結構比較清晰，腺泡腔內出現(xiàn)少量脫落的上皮細胞、中性粒細胞及淋巴細胞；M3組腺泡結構相比M2組不完整，腺泡間隙出現(xiàn)明顯的滲出液，腺泡腔內的炎性細胞相比M2組明顯增多，少部分的上皮細胞體積增大，并出現(xiàn)少量細胞壞死脫落，乳汁減少；M4組乳腺小葉結構仍能辨認，可見腺泡間隙內有滲出及出血點，乳腺上皮細胞排列疏松，乳汁減少，腺泡腔內明顯可見一定數(shù)量的炎性細胞浸潤，如中性粒細胞、淋巴細胞；M5組腺泡結構破壞嚴重，無法辨認腺泡界限，上皮細胞明顯腫脹，細胞核變大，大量細胞壞死脫落，結締組織內出現(xiàn)大量滲出的乳汁及紅細胞，腺泡腔內相比M3和M4組出現(xiàn)大量浸潤的炎性細胞(圖2)。

C.空白對照組；M1.2×105CFU/mL；M2.2×106CFU/mL；M3.2×107CFU/mL；M4.2×108CFU/mL；M5.2×109 CFU/mL

2.3 細菌計數(shù)

與對照組相比，M1組有顯著差異(P<0.05)，其余各組均有極顯著差異(P<0.01)；各組間比較，M1組與M2組差異不顯著(P>0.05)，M2組與M3組差異顯著(P<0.05)，M3、M4、M5組之間差異極顯著(P<0.01)(圖3)。

圖3 乳腺組織細菌計數(shù)

2.4 血常規(guī)

白細胞數(shù)量空白組與M1及M2組相比差異不顯著(P>0.05)，M3、M4、M5組與空白組相比顯著或極顯著增高(P<0.05或P<0.01)；中性粒細胞方面，M1及M2組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)，M3、M4、M5組與空白組相比極顯著增高(P<0.01)；血小板方面，M3組顯著高于對照組(P<0.05)，M4、M5組極顯著高于對照組(P<0.01)(表1)。

表1 各組血細胞的數(shù)量變化

2.5 乳腺組織中相關炎癥因子的含量變化

在IL-1β方面，與對照組相比，M1、M2組無顯著差異(P>0.05)，M3組顯著提高(P<0.05)，M4、M5組極顯著提高(P<0.01)；IL-6方面，與對照組相比，M1組差異不顯著(P>0.05)，M2、M3、M4、M5組均有極顯著增高(P<0.01)；TNF-α方面，與對照組相比，M1、M2組無顯著差異(P>0.05)，M3、M4、M5組均有極顯著增高(P<0.01)(表2)。

表2 乳腺組織中相關炎癥因子的含量變化

2.6 各組乳腺組織中TLR2、P-P65蛋白的表達

由圖4可知，與C組對照組相比，M1、M2組乳腺組織中TLR2及p-p65的蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，TLR2蛋白表達方面，M3、M4、M5組與C組相比極顯著升高(P<0.01)，p-p65蛋白表達方面，與C組相比，M3組顯著升高(P<0.05)，M4、M5組極顯著升高(P<0.01)。

圖4 各組乳腺組織TLR2和p-p65的蛋白表達水平

3 討論

金黃色葡萄球菌作為奶牛乳房炎最常見的病原菌之一，一直被研究人員廣泛關注[8]，有學者利用不同劑量的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成功建立了大鼠乳腺炎模型[9]，LPS已成為商品化、質量穩(wěn)定的內毒素，而引起奶牛乳房炎的細菌為具有完整細菌結構，從臨床患有乳房炎的病牛身上分離更具有說服力，所以本試驗選用從患有乳房炎的病牛乳汁中分離得到的金黃色葡萄球菌進行大鼠乳腺炎的造模。本試驗采用微量注射器直接通過乳頭管將菌液注入乳池，以模擬自然發(fā)病狀態(tài)，設置金黃色葡萄球菌2×105、2×106、2×107、2×108、2×109CFU/mL的5個濃度，以確定造成大鼠乳腺炎的最佳造模濃度。

大鼠在注菌后24 h處死，期間的臨床癥狀及剖檢腹部后的眼觀病理變化顯示，與C組相比，灌注金黃色葡萄球菌后24 h，各試驗組大鼠均發(fā)生了不同程度的炎癥反應，其中，M5組出現(xiàn)2只死亡，HE染色觀察組織病理變化發(fā)現(xiàn)，各試驗組乳腺組織充血、出血、炎性細胞浸潤以及乳腺上皮細胞壞死脫落和腺泡結構完整性出現(xiàn)不同程度的破壞，且破壞水平隨著金黃色葡萄球菌灌注濃度的增加而逐漸嚴重，大量乳腺上皮細胞破壞直接使泌乳能力降低，這與張寶君等[10]報道的隨著注菌數(shù)的增加，小鼠的乳腺組織病變逐漸加重的結果相一致；乳腺組織中的細菌數(shù)可以直接反映出乳腺的感染程度[11]。高瑞娟研究發(fā)現(xiàn)，注菌劑量越高，小鼠乳腺中菌落數(shù)越高。劉萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，試驗組小鼠乳腺組織中的細菌數(shù)與注射金黃色葡萄球菌濃度呈正比，與炎癥的嚴重程度也呈正比，本試驗所得結論與他們的結論相一致。

大鼠乳腺注入金黃色葡萄球菌后，乳腺局部會發(fā)生炎癥反應，機體為了防御細菌的侵入白細胞會從骨髓中被釋放入血[13]，數(shù)量增多，中性粒細胞作為機體非特異性免疫的先鋒部隊，具有游走和吞噬能力，在炎癥早期發(fā)揮作用[14]。張軍[15]研究發(fā)現(xiàn)，注入金黃色葡萄球菌后的大鼠血液中白細胞以及中性粒細胞數(shù)量顯著增高(P<0.05)，本試驗結果與之相一致。Yeaman M R[16]研究發(fā)現(xiàn)，血小板不僅能影響血栓形成以及內環(huán)境穩(wěn)定，而且還能在炎癥過程中發(fā)揮重要作用，炎癥會使血小板體積增大，數(shù)量增多，同時血小板可以表達多種趨化因子和細胞因子，在本試驗中，注菌濃度越高血小板數(shù)量越多，其中M4、M5組相比對照組極顯著增高(P<0.01)，這與Yeaman M R的研究結果相一致。

乳腺發(fā)生炎癥會導致中性粒細胞、單核巨噬細胞等炎性細胞增多，而炎性細胞會根據(jù)炎癥的輕重釋放少量或多量的細胞因子，比如IL-1β、IL-6、TNF-α就是典型的促炎細胞因子，IL-1β可以由多種細胞產生，過量產生在損傷乳腺組織的同時，會使小吞噬細胞向乳腺組織浸潤[17]。IL-6由急性炎癥期的中性粒細胞產生，TNF-α由巨噬細胞產生，它們在乳腺組織中的含量可以反映炎癥發(fā)生的程度，這些細胞因子大量的釋放，可以起到清除病原體的作用，但同時會引起一系列級聯(lián)反應，導致炎癥的發(fā)生[18]。李炎燚[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨著用藥濃度的增高，由金黃色葡萄球菌引起的大鼠乳腺炎乳腺中的IL-1β、TNF-α顯著減少，有效緩解炎癥。Wesson C等[20]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌感染乳腺組織及乳腺細胞時，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子分泌顯著增加。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著造模濃度的增加，IL-1β、IL-6、TNF-α在乳腺組織中的含量與金黃色葡萄球菌濃度呈正比，IL-1β含量在金黃色葡萄球菌濃度達到2×107CFU/mL時顯著升高(P<0.05)，而當濃度到達2×108CFU/mL之后出現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)，IL-6的含量在金黃色葡萄球菌濃度達到2×106CFU/mL時就表現(xiàn)出極顯著升高(P<0.01)，TNF-α含量在濃度達到2×107CFU/mL時呈現(xiàn)極顯著增高(P<0.01)，各細胞因子含量隨金黃色葡萄球菌濃度升高而升高，這與李炎燚及Wesson C等的研究結果相一致。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)在天然免疫及炎癥反應過程中起著重要作用，TLRs信號的激活可以有效控制致病原的感染，但過度的表達同樣會對機體造成損傷[21]。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色陽性菌及脂磷壁酸可以刺激TLR2的表達，同時它與乳腺炎及其他一些炎癥的發(fā)生密切相關。NF-κB是一種轉錄因子，可以被多種刺激因素激活，從而引起炎癥反應及免疫應答，它有2種亞基，分別是p50和p65，正常情況下它們與IκB組合成三聚體在胞質內，感染病原后，p65亞基發(fā)生磷酸化并進入細胞核引起相關炎癥因子的轉錄。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TLR2蛋白表達水平在M3、M4、M5組時，出現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)，這與劉明[22]關于金黃色葡萄球菌感染小鼠導致TLR2表達升高的結果相一致。p-p65的表達水平，M3組出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，M4、M5組則出現(xiàn)極顯著升高(P<0.01),這與高雪嬌[23]的研究結果相一致。

綜合各試驗組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，當金黃色葡萄球菌含菌量在2×107CFU/mL及以下時，炎癥反應較輕微或無炎癥反應，而當含菌量為2×109CFU/mL時，炎癥反應過于強烈，甚至出現(xiàn)死亡，此劑量不適合進行模型的建立，含菌量為2×108CFU/mL時，既能保證大鼠乳腺炎癥反應的完整發(fā)生，又能不引起大鼠死亡，所以本次試驗結果確立金黃色葡萄球菌引起乳腺炎的最佳含菌量為2×108CFU/mL。