齊 林， 王 蕊， 謝旭磊， 張 朝， 成志勇, 付建珠

(1.承德醫(yī)學(xué)院研究生院， 河北 承 德 067000 2.河北省石家莊市第四醫(yī)院內(nèi)科， 河北 石家莊 050000 3.河北省保定市第一醫(yī)院血液內(nèi)科， 河北 保 定 071000)

經(jīng)典BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)主要包括真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera，PV)，原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)及原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)。約95%的PV，50%的ET和PMF患者存在JAK2 V617F突變。人紅白血病HEL細(xì)胞，因其存在JAK2 V617F天然突變，故成為研究MPN的良好載體。程序性死亡受體1(Programmed Death1，PD-1)及其配體1(Programmed Death-Ligand1，PD-L1)是一對免疫共刺激因子。腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1與淋巴細(xì)胞PD-1結(jié)合，并誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受并抑制其增殖，減少細(xì)胞因子分泌，同時增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg cell)的功能，進(jìn)而使免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷力減弱[1]。研究表明,雷帕霉素(Rapamycin，Rapa)具有抑制腫瘤的作用。哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin,mTOR)是PI3K/AKT通路的組成成分之一,與腫瘤細(xì)胞增殖等密切相關(guān)。但Rapa在MPN中對其腫瘤細(xì)胞表面的PD-1/PD-L1影響報(bào)道較少。本研究初步探討了Rapa對HEL細(xì)胞PD-1/PD-L1通路以及Treg細(xì)胞的影響及相互關(guān)系，對MPN的臨床診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要藥品和試劑:Rapa購自美國Targetmol公司，規(guī)格為10mg/支，批號為T1537，使用前應(yīng)用二甲亞砜將Rapa配置成終濃度為10nM、50nM及100nM的溶液，-20℃保存。人紅白血病細(xì)胞株HEL細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，PD-1(FITC Mouse Anti-Human CD279)、PD-L1(PE Mouse Anti-Human CD274)抗體和FITC Annexin V試劑盒購自美國BD PharmingenTM公司，CCK-8試劑盒購自北京博奧森公司，Caspase 3/7活性檢測試劑盒購自上海愛必信公司，mTOR抗體購自博士德生物工程有限公司，RNA提取試劑盒購自深圳佰思珂生物公司，引物由生工生物工程公司合成，反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒均購自廣州復(fù)能基因公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):人紅白血病HEL細(xì)胞具有JAK2 V617F突變，并經(jīng)定量PCR鑒定證實(shí)，是研究MPN的良好載體[2]。將HEL細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培育，選取處于對數(shù)生長期細(xì)胞試驗(yàn)。選取2021年4月至6月在保定市第一醫(yī)院體檢的5名健康志愿者，其中男性3名，女性2名；年齡(38±11)歲，范圍25～53歲。本研究獲得保定市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有志愿者均知情同意。無菌條件下留取5例健康志愿者抗凝外周血各3mL，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，使用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.3Transwell小室細(xì)胞遷移檢測:將洗滌后對數(shù)生長期密度約為1×105/mL的HEL細(xì)胞重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)液200μL并加入上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基500μL。分別加入等體積終濃度為10nM、50nM和100nM的Rapa，空白對照組加入等體積的二甲亞砜，37℃恒溫箱培育24h。24h后，取下室的細(xì)胞懸液輕輕淋洗Transwell小室下壁，顯微鏡下計(jì)數(shù)下室細(xì)胞。

1.2.4實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)mRNA檢測:收集不同處理組1×106細(xì)胞，Trizol提取各組細(xì)胞總RNA,酶標(biāo)儀鑒定RNA純度及定量。進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系：總量為20.0μL，其中cDNA模板2μL，上、下游引物各為2μL，5×BlazeTaq qPCR Mix 4μL，ROX Reference Dye 0.1μL,ddH2O 9.9μL。擴(kuò)增條件為：95℃ 30s，95℃ 10s，60℃ 30s，40個循環(huán)。根據(jù)△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組和相對表達(dá)量=2-△△Ct，計(jì)算所檢測基因相對表達(dá)量，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值。引物序列如下：內(nèi)參基因β-actin上游引物：5′-GCG GAC ATC CGC AAA GAC-3′，下游引物：5′-AAA GGG TGT AAC GCA ACT AA-3′。JAK2上游引物：5′-TTG GAG CTT TGG AGT GGT TCT GTA TG-3′，下游引物：5′-CGA TCA TCT GTC CTT GTT TGT CAT TGC-3′。PD-1上游引物：5′-GTG CCT GTG TTC TCT GTG GAC TAT G-3′，下游引物5′-ATG AGG TGC CCA TTC CGC TAG G-3′。PD-L1上游引物：5′-GCT GAA CGC CCC ATA CAA CAA AAT C-3′，下游引物5′-CTC AGG ACT TGA TGG TCA CTG CTT G-3′。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)對HEL細(xì)胞凋亡檢測:收集各個處理組細(xì)胞，PBS清洗2遍，應(yīng)用1×Binding Buffer100μL重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V和碘化丙啶(PI)各5μL，避光孵育15min，再加入1×Binding Buffer將體系補(bǔ)至500μL，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)對PD-1/PD-L1蛋白表達(dá)檢測:收集不同處理組1×106細(xì)胞，分別取熒光標(biāo)記的PD-1抗體0.8μL和PD-L1抗體1μL加入，加入后充分混勻，室溫避光孵育15min。于室溫下避光靜置8-10min，離心棄上清。PBS洗滌1次，1mL PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。收集106個細(xì)胞，分別檢測細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)對Treg細(xì)胞檢測:收集不同組外周血單個核細(xì)胞加入熒光素標(biāo)記的單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD25。PBS緩沖液洗滌一次，離心棄上清。加1mL Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，室溫避光孵育40min。使用PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞加入二抗FOXP3，室溫避光孵育20min。PBS洗一次后重懸細(xì)胞，檢測Treg細(xì)胞。

1.2.8Caspase 3/7活性檢測:測定對硝基苯胺(p-nitroaniline，pNA)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將10mM pNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度梯度，每一梯度取100μL加入96孔板，測定405nm吸光度OD值，根據(jù)測得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別收集各處理組約1×106個細(xì)胞，加于96孔板中，每組3個復(fù)孔，設(shè)立空白對照孔和實(shí)驗(yàn)樣品孔，按100μL反應(yīng)體系將細(xì)胞、Caspase 3/7底物與緩沖液配置成反應(yīng)液，37℃孵育120min，酶標(biāo)儀測波長405nm處的吸光值，計(jì)算測得Caspase 3/7的活性。

1.2.9Western blot蛋白檢測:提取各個不同處理組細(xì)胞中的蛋白，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，分裝蛋白，將分裝好的蛋白置于金屬浴中95℃變性5min，配電泳膠，蛋白上樣，電泳使蛋白分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1×TBST配5%脫脂奶粉，室溫下封閉2h，根據(jù)一抗?jié)舛扰渲萌芤海?℃過夜，取出后TBST洗膜6次，5min/次，配二抗，室溫下封閉2h,TBST洗3遍，化學(xué)發(fā)光液混合，應(yīng)用Alpha Innotech 系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描，掃描圖像用灰度掃描軟件進(jìn)行灰度分析，取得蛋白條帶灰度值，用mTOR蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為其相對灰度，以相對灰度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

本文提出一種基于彈簧連桿機(jī)構(gòu)的工具支撐型工業(yè)裝配外骨骼機(jī)械臂，其核心為平行四邊形彈簧連桿機(jī)構(gòu)，它不僅能夠支撐工具，還具有穩(wěn)定工具的功能。該機(jī)械臂安裝在工業(yè)裝配外骨骼上，在額定載荷內(nèi)，無論是有人操縱還是無人操縱，機(jī)械臂及其所支撐的工具都能達(dá)到平衡。本文結(jié)合ADAMS仿真軟件，來研究此機(jī)械臂的相關(guān)性能。

2 結(jié) 果

2.1Rapa對HEL細(xì)胞活力影響:CCK-8結(jié)果顯示：隨著Rapa濃度增大，HEL細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性增加，不同終濃度(10nM、50nM、100nM)在72h時對細(xì)胞增殖抑制率分別為(33.33±4.6)%、(49.12±3.72)%、(55.16±4.14)%(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度Rapa對HEL細(xì)胞增殖抑制率影響

2.2Rapa對HEL細(xì)胞遷移的影響:不同濃度各組Rapa干預(yù)24h后下室細(xì)胞數(shù)分別為對照組4.4±0.45×104/mL，10nM組4.1±0.41×104/mL，50nM組3.85±0.41×104/mL,100nM組3.3±0.48×104/mL。100nM組與對照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.8957,P=0.0443)。

2.3HEL細(xì)胞Caspase 3/7活性檢測:不同濃度的Rapa作用HEL細(xì)胞24h后，與對照組比較，Caspase 3/7活性隨藥物劑量增加而升高，其中50nM組和100nM組分別與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)詳見表1。

表1 不同濃度Rapa干預(yù)24h后HEL細(xì)胞Caspase 3/7活性的變化

2.4Rapa對JAK2、PD-1、PD-L1 mRNA相對表達(dá)量的影響:應(yīng)用不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24h后，10nM組、50nM組和100nM組中JAK2 mRNA表達(dá)量和PD-L1 mRNA表達(dá)量均較對照組降低，且成藥物依賴性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組中PD-1 mRNA表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)。詳見圖2，表2。

表2 不同濃度Rapa作用24h后JAK2 PD-1 PD-L1 mRNA相對表達(dá)量的變化

圖2 不同濃度Rapa作用24h后JAK2、PD-1、PD-L1 mRNA相對表達(dá)量的變化

2.5Rapa對HEL細(xì)胞凋亡影響:不同濃度Rapa作用24h后，各組細(xì)胞凋亡率為對照組(5.9±0.6)%，10nM組(12.4±0.7)%，50nM組(26.4±0.9)%，100nM組(27.9±0.8)%。與對照組比較，10nM組、50nM組和100nM組細(xì)胞凋亡率均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=602.17，P<0.01)，且凋亡率隨藥物濃度升高而增加，詳見圖3。

圖3 不同濃度Rapa作用24h后對細(xì)胞凋亡的影響

2.6Rapa對PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)的影響:不同濃度Rapa作用24h后，10nM組、50nM組和100nM組PD-L1蛋白表達(dá)較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且隨藥物濃度增加而減低。PD-1無明顯影響(P>0.05)。詳見圖4，表3。

圖4 不同濃度Rapa作用24h后HEL細(xì)胞PD-1及PD-L1蛋白表達(dá)變化

表3 不同濃度Rapa作用24h后HEL細(xì)胞PD-1及PD-L1蛋白表達(dá)變化

2.7Rapa對Treg細(xì)胞的影響:健康志愿者淋巴細(xì)胞與HEL細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，其Treg細(xì)胞較培養(yǎng)前明顯增加(均P<0.05)，但50nM組和100nM組與對照組相比，Treg細(xì)胞增量減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且成劑量依賴性減低。詳見表4。

表4 不同濃度Rapa干預(yù)24h后Treg細(xì)胞的變化

2.8Rapa對mTOR蛋白影響:Rapa干預(yù)24h后，熒光強(qiáng)度對照組0.73±0.037，10nM組0.62±0.035，50nM組0.43±0.02，100nM組0.21±0.011。與對照組相比，10nM組、50nM組和100nM組mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，表明Rapa能夠劑量依賴性抑制mTOR蛋白表達(dá)。詳見圖5。

圖5 不同濃度Rapa干預(yù)24h后mTOR蛋白變化

3 討 論

半數(shù)以上的MPN患者存在JAK2V617突變，該突變可以導(dǎo)致Janus蛋白酪氨酸激酶2(Janus protein-tyrosine kinase，JAK2)自發(fā)性磷酸化，繼而激活下游信號分子信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)STATs蛋白異常磷酸化，并同質(zhì)二聚化及易位到細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)增殖，凋亡受抑[3]。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Rapa兼具免疫抑制作用與腫瘤抑制作用。mTOR由mTORC1和mTORC2兩部分組成。多項(xiàng)研究表明在各種實(shí)體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中存在該信號通路的不同程度活化現(xiàn)象。Rapa可抑制mTOR通路表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤生長。本研究顯示，Rapa能夠抑制HEL細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其原因可能與Caspase 3/7活性上調(diào)及細(xì)胞自噬增強(qiáng)有關(guān)。PI3K/AKT/mTOR通路是細(xì)胞中重要的信號通路之一，參與了細(xì)胞的多種生理病理活動。有學(xué)者研究顯示JAK2可以模擬生長因子信號，激活PI3K/AKT/mTOR途徑，從而抑制細(xì)胞自噬[4]。本研究發(fā)現(xiàn)Rapa能夠干擾HEL細(xì)胞JAK2的表達(dá)，并與藥物濃度相關(guān)。表明Rapa可能通過影響mTOR通路降低JAK2表達(dá)，并與促進(jìn)HEL細(xì)胞凋亡相關(guān)。其機(jī)制可能為JAK/STAT和mTOR兩通路之間存在功能干擾，即JAK2 V617F突變對mTOR通路存在激活作用，抑制mTOR通路可能對JAK/STAT通路起作用[5]。有研究表明[6]Ruxolitinib和vorinostat(組蛋白去乙酰化酶抑制劑)的聯(lián)合作用，結(jié)果顯示二者通過減弱JAK-STAT和AKT信號通路，誘導(dǎo)HEL細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期阻滯和抑制HEL細(xì)胞集落形成，具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。故JAK/STAT和mTOR兩通路之間的功能串?dāng)_，可能成為聯(lián)合用藥治療MPN的一個依據(jù)。

多種腫瘤細(xì)胞存在PD-1/PD-L1的過表達(dá),導(dǎo)致Treg細(xì)胞活性增強(qiáng)及抗腫瘤T細(xì)胞失能,并與不良預(yù)后相關(guān)[7]。有研究已證實(shí)在MPN患者腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)PD-1和PD-L1[8]。正常情況下，PD-1通過其配體 PD-L1發(fā)揮免疫調(diào)控作用。PD-1/PD-L1信號通路的激活可導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷。在多數(shù)MF患者中，JAK2的激活可上調(diào)PD-1的表達(dá)并加速T細(xì)胞的耗竭。在應(yīng)用JAK1/2抑制劑ruxolitinib后，能夠?qū)е耇淋巴細(xì)胞的活化受到明顯抑制，且降低了T淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)，提示ruxolitinib可通過PD-1通路改善自身免疫環(huán)境，提高治療效果。本研究顯示早期HEL細(xì)胞表面PD-1及PD-L1均可受Rapa影響而表達(dá)下降。Rapa對PD-1和PD-L1的干擾機(jī)制尚不清楚，有研究顯示結(jié)腸癌中激活的AKT/mTOR通路導(dǎo)致腫瘤表面PD-L1高表達(dá)，而在應(yīng)用Rapa后，腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)下調(diào)[9]，本研究支持上述研究結(jié)論。此外本研究顯示健康人Treg細(xì)胞比例較低，與HEL細(xì)胞共培養(yǎng)后所占比例升高，應(yīng)用不同濃度的Rapa后，Treg細(xì)胞比例劑量依賴性下降。推測Rapa能夠通過抑制mTOR信號通路參與調(diào)控了MPN患者免疫微環(huán)境。

本研究表明，Rapa能夠通過抑制mTOR通路串?dāng)_JAK/STAT通路及PD-1/PD-L1信號通路進(jìn)而抑制HEL細(xì)胞增殖、遷移和Treg細(xì)胞比例，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這為Rapa聯(lián)合JAK2抑制劑治療JAK2 V617F陽性骨髓增殖性腫瘤患者提供了理論依據(jù)。