米 磊， 苗 輝， 徐 揚(yáng)， 王永華， 慕彩琴， 徐建華

(陜西省榆林市第一醫(yī)院口腔科， 陜西 榆林 719000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的主要侵襲形式，其發(fā)病率和死亡率已居世界第六位[1]。手術(shù)切除和放療是目前治療OSCC最有效的兩種方法，但治療效果仍不理想[2]。據(jù)癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，晚期OSCC患者的五年生存率不到50%，而腫瘤的頻繁復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致OSCC相關(guān)死亡的主要原因[3]。因此尋找有效的OSCC早期診斷因子，甚至尋找新的治療靶點(diǎn)來(lái)對(duì)抗OSCC發(fā)展都將具有重要的臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的且不具備蛋白編碼功能的RNA分子[4]。在OSCC中，lncRNAs可作為抑癌基因或促癌基因參與調(diào)控OSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示了其在OSCC中異常表達(dá)的lncRNAs可能成為診斷和治療該疾病的重要靶標(biāo)[5,6]。LncRNA CYTOR已被證實(shí)在包括胃癌和膽囊癌在內(nèi)的多種癌癥類(lèi)型中表達(dá)異常，且可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲發(fā)揮促癌作用[7]。此外lncRNA CYTOR還可通過(guò)海綿miR-3148參與FOX1介導(dǎo)的OSCC化療耐藥。然而，lncRNA CYTOR在OSCC中的表達(dá)及具體作用仍需進(jìn)一步研究。本研究以O(shè)SCC細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)觀察lncRNA CYTOR對(duì)OSCC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的影響及潛在調(diào)控通路，旨在揭示lncRNA CYTOR在OSCC發(fā)展過(guò)程中的具體作用，以及為OSCC的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料:人正常口腔角質(zhì)形成細(xì)胞株(NHOK)和OSCC細(xì)胞株(Tca8113、CAL27、SCC9和SCC25)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)ATCC；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、RIPA細(xì)胞裂解液和TRIzol試劑購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Gibco公司；Transwell小室(8μm)和Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)BD Falcon公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)買(mǎi)自上海碧云天生物科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prism ScriptTMRT Reagent kit和PCR熒光定量試劑盒SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)買(mǎi)自日本Toyobo公司；siRNA-lncRNA CYTOR及其陰性對(duì)照siRNA-NC質(zhì)粒合成自上海漢恒生物公司；一抗PCNA、Ki-67、c-myc、cyclin D1、β-catenin和GAPDH購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗購(gòu)買(mǎi)自北京中山生物技術(shù)公司；PCR引物合成自上海生工有限公司合成；其他常見(jiàn)分子生物學(xué)相關(guān)試劑與耗材購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):正?？谇患?xì)胞(NHOK)和口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(Tca8113、CAL27、SCC9和SCC25)均用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。加濕培養(yǎng)箱條件為95%相對(duì)濕度，5%CO2和37℃。對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞被收集起來(lái)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。后續(xù)細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果取平均值。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將CYTOR表達(dá)水平最高的CAL27細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)象。對(duì)數(shù)期CAL27細(xì)胞按照4×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，并隨機(jī)分為Control組、si-CYTOR組和si-NC組。當(dāng)CAL27細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，利用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑將si-CYTOR和si-NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到si-CYTOR組細(xì)胞和si-NC組細(xì)胞，Control組細(xì)胞不做任何處理。轉(zhuǎn)染48h后，RT-qPCR用于檢測(cè)CYTOR表達(dá)以驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞lncRNA CYTOR mRNA表達(dá):通過(guò)使用TRIzol試劑從轉(zhuǎn)染后的CAL27細(xì)胞中提取總RNA。經(jīng)純化后，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prism ScriptTMRT Reagent kit將純化的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，嚴(yán)格按照PCR熒光定量試劑盒SYBR Green qPCR Master Mix操作說(shuō)明，在ABI 7300實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上實(shí)施PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-△△Ct方法對(duì)lncRNA CYTOR基因的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物序列如下所示：lncRNA CYTOR引物序列，F(xiàn):5′-AGAATGAAGGCTGAGGTGTG-3′和R:5′-CAGCGACCATCCAGTCATTTA-5′；GAPDH引物序列，F(xiàn):5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′和R:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.2.4CCK-8、克隆形成和EdU染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖:CCK-8法：將轉(zhuǎn)染后的CAL27細(xì)胞按照2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。在常規(guī)培養(yǎng)0、24、48和72和96h加入10μL的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2h。用自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450nm處的光密度(OD)以表示細(xì)胞存活率。克隆形成：將轉(zhuǎn)染后的CAL27細(xì)胞按照1×103個(gè)/孔的密度接種到6孔板中常規(guī)培養(yǎng)2周。培養(yǎng)結(jié)束后先用4%甲醇固定細(xì)胞，隨后用0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞形成的菌落進(jìn)行染色。用光學(xué)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)直徑大于100μm的細(xì)胞集落數(shù)。EdU染色：將轉(zhuǎn)染后的CAL27細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中常規(guī)培養(yǎng)24h。將100μL EdU溶液加入96孔板中與細(xì)胞共孵育2h，然后加入固定液繼續(xù)孵育15min。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，加入熒光標(biāo)記的EdU反應(yīng)混合物孵育30min。孵育完成后，用激光共聚焦熒光顯微鏡對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行拍照觀察。EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲:細(xì)胞通過(guò)孔徑為8μm的Transwell小室進(jìn)行侵襲。將轉(zhuǎn)染后的CAL27細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL的懸液并將200μL不含胎牛血清的細(xì)胞懸液填充在鋪滿(mǎn)Matrigel基質(zhì)膠的上室中。下室填充600μL的含10%胎牛血清的細(xì)胞懸液。常規(guī)孵育24h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次后，在室溫下用4%冷甲醇固定細(xì)胞30min，然后用0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色處理15min。染色后的細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。在細(xì)胞遷移試驗(yàn)中，Transwell上室中沒(méi)有Matrigel涂層，其他步驟與侵襲步驟保持一致。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCNA、Ki-67、c-myc、cyclin D1和β-catenin蛋白表達(dá):通過(guò)RIPA裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染后的CAL27細(xì)胞后，用BCA蛋白定量分析試劑盒檢測(cè)CAL27細(xì)胞提取蛋白的濃度。隨后，蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用10%的脫脂奶粉對(duì)膜蛋白進(jìn)行封閉操作1.5h后，與相應(yīng)的一抗PCNA(1∶2,000;ab18197;Abcam)、Ki-67(1∶1,000;ab15580;Abcam)、c-myc(1∶5,000;ab39688;Abcam)、cyclinD1(1∶5,000;ab15196;Abcam)、β-catenin(1∶5000;ab32572;Abcam)和GAPDH(1∶1,000;ab14247;Abcam)在4℃下過(guò)夜孵育，隨后再與相應(yīng)的二抗(1∶2,000;ab6877;Abcam)共孵育4h。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。收集的蛋白條帶用Image J軟件進(jìn)行歸一化和量化處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用t檢驗(yàn)或單因素方差(one-way ANOVA)分析結(jié)果。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA CYTOR在正常NHOK細(xì)胞和OSCC細(xì)胞中的表達(dá):如圖1A所示，相比較正常NHOK細(xì)胞，CYTOR在OSCC細(xì)胞(Tca8113、CAL27、SCC9和SCC25)中的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。其中，CAL27細(xì)胞中的CYTOR表達(dá)最高，因此CAL27細(xì)胞被篩選用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。同時(shí)，利用特異性siRNA下調(diào)CYTOR的表達(dá)。如圖1B所示，相比較si-NC組，CYTOR在si-CYTOR組細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，提示了細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。上述結(jié)果表明CYTOR在OSCC細(xì)胞中的異常表達(dá)可能對(duì)OSCC發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要調(diào)控作用。

圖1 LncRNA CYTOR在正常NHOK細(xì)胞和OSCC細(xì)胞中的表達(dá)

2.2下調(diào)lncRNA CYTOR表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞增殖能力的影響:如圖2A所示，相比較si-NC組，si-CYTOR組細(xì)胞的細(xì)胞活性明顯下降。在72h時(shí)，si-CYTOR組細(xì)胞的活性相比較si-NC組細(xì)胞具有顯著性差異(P<0.01)。如圖2B所示，相比較si-NC組，si-CYTOR組細(xì)胞形成的集落數(shù)目顯著減少(P<0.01)。如圖2C所示，相比較si-NC組，si-CYTOR組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著減少(P<0.01)。最后，如圖2D所示，相比較si-NC組，增殖相關(guān)蛋白(PCNA和Ki-67)在si-CYTOR組細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。上述結(jié)果表明抑制CYTOR表達(dá)后，CAL27細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。

圖2 下調(diào)lncRNA CYTOR表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞增殖能力的影響

2.3下調(diào)lncRNA CYTOR表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響:如圖3A所示，相比較si-NC組，si-CYTOR組細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(P<0.01)。同時(shí)，如圖3B所示，相比較si-NC組，si-CYTOR組細(xì)胞的侵襲能力也明顯減弱(P<0.01)。上述結(jié)果表明，抑制CYTOR表達(dá)后，CAL27細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降。

圖3 下調(diào)lncRNA CYTOR表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

2.4下調(diào)lncRNA CYTOR表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin通路蛋白的影響:如圖4所示，相比較si-NC組，si-CYTOR組細(xì)胞中的c-myc、cyclin D1和β-catenin蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制CYTOR的表達(dá)能有效抑制OSCC細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin通路的阻斷有關(guān)。

圖4 下調(diào)lncRNA CYTOR表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

LncRNAs在蛋白編碼基因調(diào)控中的重要性，尤其是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)腫瘤進(jìn)展的調(diào)控作用已眾所周知。在OSCC中，大量的lncRNAs被檢測(cè)出異常表達(dá)，這些差異表達(dá)的lncRNAs通常與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后或診斷密切相關(guān)，可作為癌基因或抑癌基因存在[8]。因此，不斷發(fā)現(xiàn)和探討新的lncRNAs在OSCC中的作用和調(diào)控機(jī)制對(duì)OSCC的診斷和治療具有重要意義。

本研究首先通過(guò)PCR檢測(cè)了4種OSCC細(xì)胞相比較正?？谇患?xì)胞內(nèi)lncRNA CYTOR表達(dá)的差異性，結(jié)果表明lncRNA CYTOR在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，提示了lncRNA CYTOR可能作為原癌基因參與OSCC的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報(bào)道，lncRNA CYTOR作為一種腫瘤相關(guān)的非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)各類(lèi)癌癥的病理過(guò)程。例如，Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CYTOR可以通過(guò)與核仁素和KH結(jié)合域相互作用，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮癌基因作用進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。截至目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)研究證明lncRNA CYTOR在OSCC中的作用。因此，為了探究lncRNA CYTOR在OSCC中的具體作用，在實(shí)驗(yàn)中選擇了表達(dá)差異性最大的CAL27細(xì)胞用于后續(xù)體外細(xì)胞研究，同時(shí)siRNA用于下調(diào)CAL27細(xì)胞內(nèi)的lncRNA CYTOR表達(dá)。細(xì)胞體外表型功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OSCC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力在lncRNA CYTOR基因敲除后明顯受到抑制。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果肯定了lncRNA CYTOR在OSCC進(jìn)展中的促癌作用。lncRNA CYTOR在OSCC中的下游調(diào)控通路在本研究中也做了初步探索。在確定lncRNA CYTOR在OSCC中的促癌作用后，進(jìn)一步檢測(cè)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。研究表明抑制lncRNA CYTOR表達(dá)能有效下調(diào)c-myc、cyclin D1和β-catenin蛋白表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的經(jīng)典途徑之一，而β-catenin的磷酸化在這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。研究表明Wnt蛋白與細(xì)胞膜受體的相互作用可以抑制β-catenin的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚。過(guò)度積聚的β-catenin會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子相互作用，進(jìn)而激活下游靶基因例如原癌基因c-myc和周期蛋白Cyclin D1等的表達(dá)，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移和過(guò)度增殖。目前已有大量研究證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活與OSCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。綜上所述，lncRNA CYTOR能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。

結(jié)果表明了lncRNA CYTOR在OSCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的促癌作用。然而，lncRNA CYTOR在OSCC中發(fā)揮作用的下游調(diào)控基因還有待進(jìn)一步研究。