孫同友， 趙麗霞， 崔玉潔， 周 碩， 梁秀軍， 孫大永

(1.河北省承德市中心醫(yī)院， 河北 承 德 067000 2.河北省人民醫(yī)院腫瘤五科， 河北 石家莊 050057 3.承德醫(yī)學(xué)院研究生院， 河北 承 德 067000 4.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 河北 承 德 067000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的胃腸道惡性腫瘤，起源于結(jié)直腸黏膜上皮，包括結(jié)腸和直腸的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)CRC的發(fā)病率和死亡率分別占所有惡性腫瘤發(fā)病的第3位和第2位[1]。我國的形勢也很嚴(yán)峻，根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的2015年我國惡性腫瘤流行病學(xué)數(shù)據(jù)，CRC發(fā)病占全組人群的第3位，其導(dǎo)致的死亡占第5位，造成了很大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。對(duì)于局限性疾病，手術(shù)、放療和化療等標(biāo)準(zhǔn)治療手段的療效尚可[3]，盡管如此，最終40%以上的患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前手段對(duì)轉(zhuǎn)移性CRC的治療仍然具有挑戰(zhàn)性。在過去幾十年里，細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合化療一直是治療晚期CRC的主要措施，為了尋求突破，人們通過化療聯(lián)合生物靶向藥物來提高總生存率(overall survival,OS)，盡管如此，晚期CRC的5年生存率仍然相對(duì)較低，僅為14%左右，與局部區(qū)域性CRC相比，其平均OS約為30個(gè)月，療效不能令人滿意[4]。因此，探索新的針對(duì)晚期CRC的有效藥物及治療手段顯得尤為重要。rmhTRAIL(CPT)是野生型TRAIL環(huán)化變構(gòu)而來，其在安全性、穩(wěn)定性、溶解性及抗癌生物活性方面都表現(xiàn)的更佳[5]。課題組前期體外研究結(jié)果顯示CPT單藥及其與5-FU聯(lián)用對(duì)CRC細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果向體內(nèi)研究結(jié)果轉(zhuǎn)化的橋梁，在癌癥發(fā)生機(jī)制及藥理學(xué)研究中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。皮下接種異位移植瘤模型因?yàn)槠洳僮骱唵巍⒊闪雎矢呒澳[瘤生長快等特點(diǎn)，是人類研究癌癥過程中最常使用的方法之一[6]。故本實(shí)驗(yàn)選擇6周齡雌性BALB/c裸鼠，建立人CRC皮下移植瘤模型，研究CPT單藥及其與5-FU聯(lián)合對(duì)裸鼠皮下移植瘤的抑制作用，以期為今后臨床應(yīng)用CPT治療結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:人CRC HCT116細(xì)胞株由聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院腫瘤科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；體重18-22g的BALB/c裸鼠，6周齡、雌性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購買，動(dòng)物許可證為SCXK(京)2016-0011。SPF級(jí)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于恒定溫度和濕度的環(huán)境中，飼料及飲水均經(jīng)滅菌處理，一籠5只裸鼠，每日光照12h。

1.1.2主要試劑:CPT由北京沙東生物公司饋贈(zèng)；氟尿嘧啶注射液由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；1640培養(yǎng)液(Gibco)、PBS緩沖液(HyClone)；FBS(胎牛血清，Gibco)、0.25%含EDTA胰酶(Sigma)；TUNEL(羅氏公司)、DAPI(上海碧云天公司)、異氟烷(上海雅培制藥有限公司)、激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)、OCT冰凍切片包埋劑(美國SAKURA公司)、電子游標(biāo)卡尺(美國Fisher公司)、手術(shù)器械(美國Fisher公司)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及建立裸鼠移植瘤模型:人CRC細(xì)胞HCT116培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，并置于5% CO2、37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，每天換液1次，用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞傳代。將HCT116細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，測得細(xì)胞懸液密度為5×107個(gè)/mL，于25只裸鼠右側(cè)腋窩中部外側(cè)皮下分別注射單細(xì)胞懸液120μL。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥:自接種之日起，每隔1d觀察裸鼠右側(cè)腋窩接種部位皮下成瘤情況，利用游標(biāo)卡尺測量裸鼠結(jié)直腸癌移植瘤的長短徑，并根據(jù)公式算出腫瘤體積，公式：腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。實(shí)驗(yàn)分組：待皮下移植瘤大小至100-120mm3時(shí)，將25只裸鼠隨機(jī)分為5組，每組5只：對(duì)照組，5-FU組，CPT組，CPT低劑量聯(lián)合5-FU組及CPT高劑量組聯(lián)合5-FU組，每組5只。治療劑量及方法：對(duì)照組注射生理鹽水；5-FU組每次的劑量為每只5mg/kg，采取尾靜脈注射的方式；CPT單藥組的劑量為每次每只7.5mg/kg，以腹腔注射的方式給藥；CPT聯(lián)合5-FU組，5-FU給藥劑量及方式同前，CPT腹腔注射劑量為每次每只2.5mg/kg或7.5mg/kg，兩藥給藥間隔時(shí)間為4h。每2d注射一次，一共給藥10次?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及既往文獻(xiàn)報(bào)道選擇給藥劑量以及給藥方式[7]。

1.2.3觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況、測量體重及腫瘤長短徑:自用藥當(dāng)天開始，每天觀察并記錄動(dòng)物的精神、活動(dòng)、飲食、飲水等一般表現(xiàn)，并觀察皮下移植瘤有無紅腫破潰；裸鼠體重每5d測量1次、并測量皮下移植瘤的長短徑。所有動(dòng)物均在用藥第25天采用頸椎脫臼法迅速處死，剝離腫瘤，測量大小，稱量瘤重，拍攝照片，根據(jù)公式算出第25天時(shí)的移植瘤腫瘤抑制率和體積抑制率。腫瘤抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組瘤重/對(duì)照組瘤重)×100%；腫瘤體積抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組瘤體積/對(duì)照組瘤體積)×100%。

1.2.4TUNEL/DAPI雙染檢測細(xì)胞凋亡:將剝除的移植瘤組織用冰凍切片機(jī)制成冰凍切片，切片的厚度3μm。按TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶“dUTP”介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法)/DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)試劑盒操作說明檢測細(xì)胞凋亡：4%多聚甲醛常溫固定切片20min，用PBS漂洗30min，細(xì)胞通透液破膜通透2min，PBS漂洗后加TUNEL反應(yīng)混合液(TdT+熒光素標(biāo)記的dUTP)避光孵育60min，加DAPI避光孵育5min，PBS漂洗3次后用甘油封片，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，于400倍視野下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，并拍照。

2 結(jié) 果

2.1CPT和5-FU對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活狀態(tài)的影響:在研究進(jìn)程中，給藥后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均一般情況良好，未出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩、不思飲食等情況；移植瘤表面未見出血及壞死，每組裸鼠均未見死亡發(fā)生。統(tǒng)計(jì)顯示，藥物對(duì)裸鼠體重的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F藥物=0.174，P=0.949)，時(shí)間對(duì)裸鼠體重的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=150.864，P<0.001)，分組和時(shí)間對(duì)動(dòng)物體重影響的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F交互=24.648，P<0.001)。從實(shí)驗(yàn)開始到第10天各組動(dòng)物體重逐漸增大，而從第10天到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，只有對(duì)照組和CPT組動(dòng)物體重小幅上升，其它組動(dòng)物體重逐漸減小。見圖1。

圖1 CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的影響

2.2CPT聯(lián)合5-FU對(duì)裸鼠皮下移植瘤的生長抑制作用:人CRC裸鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建成功，重復(fù)測量的方差分析結(jié)果顯示：時(shí)間和藥物之間具有交互效應(yīng)(F交互=118.779，P<0.001)，且藥物和時(shí)間對(duì)裸鼠皮下移植瘤的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=249.381，P<0.001；F時(shí)間=1577.999，P<0.001)，皮下移植瘤體積隨著時(shí)間的延長而逐漸增大，與其它組比較，高劑量CPT聯(lián)合5-FU組移植瘤體積增大最為遲緩(P<0.01)。在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，單用CPT或5-FU均能抑制裸鼠人CRC皮下移植瘤生長(P<0.01)；當(dāng)CPT與5-FU聯(lián)合時(shí)，抑制人CRC皮下移植瘤的生長作用愈加顯著，且以高劑量CPT(7.5mg/kg)聯(lián)合5-FU組最為明顯，與其它組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合組之間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，以對(duì)照組裸鼠移植瘤體積最大，而高劑量CPT聯(lián)合5-FU組的腫瘤體積最小。見圖2和表1。剝?nèi)∧[瘤稱量瘤重，統(tǒng)計(jì)顯示：各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.112,P<0.001)，對(duì)照組腫瘤質(zhì)量最大，單藥5-FU及CPT組的瘤重與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但兩單藥組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合組與單藥組及對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而兩聯(lián)合組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖2 CPT聯(lián)合5-FU對(duì)皮下移植瘤體積的影響

圖3 CPT聯(lián)合5-FU對(duì)皮下移植瘤的生長抑制作用

圖4 CPT聯(lián)合5-FU對(duì)皮下移植瘤重量的影響

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)裸鼠移植瘤體積及抑瘤率

表2 裸鼠移植瘤質(zhì)重及瘤重抑制率

2.3CPT聯(lián)合5-FU對(duì)人CRC裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞凋亡的影響：激光共聚焦顯微鏡掃描顯示TUNEL/DAPI染色后CPT聯(lián)合5-FU治療的裸鼠腫瘤細(xì)胞呈綠色熒光，而未經(jīng)治療的對(duì)照組或單藥CPT及5-FU組治療的裸鼠腫瘤細(xì)胞沒有顯示明顯的綠色熒光，表明CPT與5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡；對(duì)凋亡腫瘤細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)顯示：各組間均數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=201.784,P<0.001)，其它組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，聯(lián)合組與兩單藥組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組之間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表3。

圖5 CPT聯(lián)合5-FU對(duì)皮下植瘤細(xì)胞凋亡的影響

表3 腫瘤凋亡細(xì)胞數(shù)

3 討 論

隨著分子生物學(xué)和分子診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，科學(xué)家們認(rèn)識(shí)到癌癥發(fā)生不僅涉及細(xì)胞凋亡通路受阻、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，還可由一種或多種抑癌基因失活或原癌基因激活所引起，是一個(gè)多步驟多階段的復(fù)雜過程。CRC發(fā)生的危險(xiǎn)因素主要包括遺傳易感性、表觀遺傳學(xué)改變、飲酒、高脂肪飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)以及腸道黏膜的慢性炎癥等[8]。從結(jié)腸腺瘤發(fā)展到CRC涉及到多個(gè)基因的缺失或突變，包括APC基因缺失、RAS癌基因突變以及抑癌基因DCC和p53的缺失等[9]?；趯?duì)癌癥發(fā)病機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，針對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的某個(gè)或某些靶點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)打擊的靶向治療在惡性腫瘤治療中取得了很大進(jìn)展，而在CRC中以靶向抗腫瘤血管生成治療藥物進(jìn)展最為迅速，這類藥物主要包括針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)的大分子單抗以及血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)的小分子酪氨酸激酶抑制劑(VEGFR-TKIs)[10]。雖然靶向抗腫瘤血管生成藥物在CRC治療中取得了一定療效，但是由于缺乏有效且可靠的預(yù)測療效的標(biāo)志物以及獲得性耐藥等問題，總體療效仍不盡如人意。近幾年，免疫治療藥物異軍突起，給腫瘤病人帶來了新的希望和治療選擇。在有高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定/錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷(MSI-H/dMMR)的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic Colorectal Cancer，mCRC)中，免疫治療的療效較傳統(tǒng)治療手段顯著提高[11]，但是，只有5%左右的mCRC患者伴有MSI-H/dMMR，而不具備MSI-H/dMMR的mCRC對(duì)免疫治療的反應(yīng)性較差。

TRAIL不同于傳統(tǒng)的化療藥物，也不同于靶向以及免疫治療藥物，它能靶向性的殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性，這使它成為被寄予厚望的抗癌明星因子。CPT是由TRAIL環(huán)化變構(gòu)后得到，其在穩(wěn)定性、半衰期及抗癌活性等方面均強(qiáng)于TRAIL。我們第一次報(bào)道了CPT單藥及其聯(lián)合5-FU在體外能抑制CRC細(xì)胞的增殖并能誘導(dǎo)其凋亡。嚙齒動(dòng)物在生理功能和結(jié)構(gòu)方面與人類相似，被認(rèn)為是研究CRC良好的模型。將細(xì)胞懸液注射于BALB/C裸鼠腋下建立了CRC移植瘤模型，來評(píng)價(jià)藥物的抗腫瘤活性。在本研究中，我們也成功構(gòu)建了人CRC裸鼠皮下移植瘤模型，并應(yīng)用CPT聯(lián)合5-FU的方案治療，觀察體內(nèi)抗腫瘤效果，5-FU的用量為5mg/kg，遠(yuǎn)低于臨床常用劑量，且明顯低于其它實(shí)驗(yàn)中的用量[12,13]。結(jié)果顯示：各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)治療方案耐受性良好，未出現(xiàn)拒食、死亡等情況，各組動(dòng)物在體重上未見明顯差異。單藥CPT或CPT聯(lián)合5-FU均能抑制CRC移植瘤生長；繪制移植瘤生長體積曲線顯示與對(duì)照組相比，治療組移植瘤的生長速度明顯較慢，且以高劑量CPT與5-FU聯(lián)合組移植瘤的生長最慢；稱量裸鼠移植瘤的瘤重，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組裸鼠移植瘤的瘤重明顯低于對(duì)照組及單藥組，并且以7.5mg/kg的CPT聯(lián)合5-FU組瘤重減輕最顯著，這表明高濃度CPT有更強(qiáng)的抑制裸鼠移植瘤生長作用，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

本研究應(yīng)用TUNEL/DAPI染色法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示CPT、5-FU及兩者聯(lián)合治療也引起了移植瘤細(xì)胞凋亡，激光掃描共聚焦顯微鏡下可見代表細(xì)胞凋亡的綠色熒光，以大劑量CPT聯(lián)合5-FU引起的裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡最明顯，且與其它組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而兩單藥組之間相比細(xì)胞凋亡沒有顯著差異，考慮主要與用藥劑量較小及機(jī)體復(fù)雜代謝環(huán)境等因素有關(guān)。本研究首次探討CPT聯(lián)用5-FU對(duì)CRC的治療作用，有很多方面需要總結(jié)和完善，比如選擇不同的CRC細(xì)胞系、嘗試多種劑量組合方案、對(duì)移植瘤組織中凋亡通路有關(guān)分子進(jìn)行檢測等。

綜上，本研究結(jié)果表明CPT單藥及其與5-FU聯(lián)合治療CRC在體內(nèi)也展示出了良好的抗腫瘤活性，且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無明顯毒性。這為深入探索CPT聯(lián)合5-FU治療CRC提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。