周海寧，尹 才，馬 龍，王晶鈺

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.寧夏動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750011)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，能夠感染山羊、綿羊和野生小反芻獸等動物，以發(fā)熱、口腔及舌黏膜糜爛、流淚、流鼻液、腹瀉和肺炎等癥狀為主要特征[1]。

PPRV為有囊膜的多形性單股負(fù)鏈RNA病毒，含有15 948個核苷酸。該基因共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中6種結(jié)構(gòu)蛋白依次為N蛋白、M蛋白、P蛋白、L蛋白，還有2種外部蛋白F和H，這兩種蛋白可在感染后激起機(jī)體保護(hù)反應(yīng)。

PPRV F基因與所有副黏病毒一樣，其翻譯產(chǎn)物F0蛋白無活性，蛋白裂解后產(chǎn)生的F1和F2才具有活性[3]。研究顯示，PPRV-F基因編碼的融合蛋白(F蛋白)是決定病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵，具有誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞溶血素、促進(jìn)細(xì)胞融合以及啟動病毒感染細(xì)胞等生物學(xué)活性。當(dāng)前，PPR尚無有效治療方式，主要通過早期診斷和疫苗免疫的方式進(jìn)行控制。有研究顯示，F(xiàn) 蛋白在麻疹病毒屬中是主要的保護(hù)性免疫原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[4]。另有研究報道，不同地區(qū)來源PPRV-F基因毒株譜系不同，通過對F基因核苷酸序列進(jìn)行分析，可以為該病毒在不同地理區(qū)域間的傳播途徑提供線索[5-6]。因此，本研究以寧夏地區(qū)采集的疑似PPR的病料為研究對象，提取樣品RNA，RT-PCR擴(kuò)增PPRV-F基因，通過分子鑒定驗(yàn)證該病料是否為PPRV陽性；同時，通過對本研究獲得的F基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，闡明寧夏感染的PPRV的譜系以及F蛋白的分子特征，為進(jìn)一步探索該病毒在不同地理區(qū)域間的傳播情況，研究該基因的功能，制備亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 本試驗(yàn)所用病料由寧夏動物疾病預(yù)防控制中心于2016年采集。該病料來源于寧夏回族自治區(qū)銀川市西夏區(qū)某發(fā)病山羊養(yǎng)殖場，根據(jù)臨床癥狀及剖檢變化，初步判斷為小反芻獸疫疑似病例，采集該發(fā)病山羊淋巴結(jié)、肝、脾臟等組織帶回實(shí)驗(yàn)室，置-70℃保存。

1.1.2 主要試劑 Trans Script one-step RT-PCR Super MIX購自全式金生物技術(shù)有限公司；病毒RNA提取試劑盒購自蘇州天隆科技有限公司；核酸分子標(biāo)準(zhǔn)購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PPRV總RNA的提取 取2 mg發(fā)病羊組織樣本，加入石英砂，用無菌無核酶研缽充分研磨，加入無核酶PBS(pH7.4)，制成1∶5～1∶10懸液，液氮反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心2 min，取上清液備用。用RNA提取試劑盒提取上清液樣品中病毒總RNA，具體步驟參考試劑盒說明書。提取的總RNA測定濃度及純度，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的Kurdistan株P(guān)PRV-F基因序列(登錄號：KF648287)，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)1對引物，其中上游引物(F-f)為：5′-ATGACACGGGTCGCAATCTTGA-3′；下游引物(F-r)為：5′-CTACAGTGATCTCACGTACGAC-3′。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小1 641 bp，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，用dd H2O按10 pmol/μL稀釋，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PPRV-F基因的RT-PCR擴(kuò)增 以PPRV總RNA為模板，使用TransScript one-step RT-PCR SuperMix進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：在20 μL的反應(yīng)體系中加入2×One-Step Reaction Mix 10 μL，TransScript One-Step Enzyme Mix 0.4 μL，10 pmol/μL上、下游引物各0.4 μL，RNA模板2 μL，加滅菌水水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：45℃反轉(zhuǎn)錄20 min；94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 40 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，觀察和記錄結(jié)果。將目的條帶切膠回收純化后，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 PPRV-F基因的核苷酸序列分析 將獲得的序列，輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，驗(yàn)證獲得的病料是否為PPRV陽性樣品。

1.2.5 PPRV-F基因進(jìn)化樹分析 從GenBank中下載不同毒株的PPRV-F基因序列，具體如下：China Fu Yang株(登錄號：MF443335)、China GD株(登錄號：MF443352)、China HeN株(登錄號：MF443347)、China SC株(登錄號：MF443338)、China Tibet株(登錄號：EU364809)、China XJYL株(登錄號：KM091959)、Mongolia株(登錄號：KY888168)、China ZJ株(登錄號：MF443335)、China XJBZ株(登錄號：KT633939.1)、China Tibet株(登錄號：EU364809.1)、Morocco(登錄號：KC609746.1)、Kurdistan(登錄號：KF648287.1)、India(登錄號：KF752444.1)、Netherlands(登錄號：KJ867542.1)、India(登錄號：GQ410435.1)、India(登錄號：JN632534.1)、Nigeria(登錄號：HQ197753.1)、Benin(登錄號：KR781450.1)、Ghana(登錄號：KJ466104.1)、Nigeria(登錄號：EU267274.1)、west Africa(登錄號：KP789375.1)、Cote dlvire(登錄號：EU267273.1)、Uganda(登錄號：KJ867543.1)、Kenya(登錄號：KM463083.1)、Oman(登錄號：KJ867544.1)、UAE(登錄號：KJ867545.1)。用MAGA 5.1構(gòu)建PPRV-F基因進(jìn)化樹，分析本試驗(yàn)獲得的樣品與其他地區(qū)分離株的親緣關(guān)系。

1.2.6 PPRV-F基因編碼氨基酸序列分析及F蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用生物信息學(xué)方法，通過網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對PPRV-F基因編碼的蛋白進(jìn)行分析，其中包括氨基酸序列分析：SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，ExPASY(http://web.expasy.org/protparam/)；信號肽預(yù)測：(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜區(qū)預(yù)測：(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；抗原性預(yù)測：(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：Jpred3(http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred)；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)。

2 結(jié)果

2.1 樣品PPRV-F基因的RT-PCR擴(kuò)增

提取本中心獲得的疑似PPRV陽性樣品RNA，以此為模板，經(jīng)一步法RT-PCR擴(kuò)增，獲得PPRV-F基因，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，片段大小約為1 600 bp，與預(yù)期的結(jié)果相符，初步證明本次獲得的病料為PPRV陽性樣品(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～2.樣品RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1-2.RT-PCR amplification products of PPRV samples

圖1樣品PPRV-F基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 The results of PPRV-F gene amplification by RT-PCR

2.2 PPRV-F基因核苷酸序列分析

將PCR擴(kuò)增為陽性的條帶經(jīng)膠回收純化以后，進(jìn)行測序。所獲得的序列，經(jīng)測序大小為1 641 bp，將序列輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與Kurdistan株(登錄號：KF648287.1)F基因核苷酸的同源性為97%，進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)室獲得的病料為PPRV陽性樣品。

2.3 不同毒株P(guān)PRV-F基因同源性分析

將寧夏獲得的PPRV-F基因與GenBank下載的不同毒株的PPRV-F基因進(jìn)行核苷酸同源性分析。結(jié)果顯示，寧夏獲得的PPRV-F基因與ChinaZJ(MF443335.1)、ChinaSC(MF443338.1)、ChinaHeN(MF443347.1)、ChinaGD(MF443352.1)和ChinaXJYL(KM091959.1)等毒株同源性高達(dá)99.6%，與Mongolia株(KY888168.1)同源性高達(dá)99.3%，與ChinaXJBZ株(KT633939.1)同源性為98.1%；與我國所用疫苗株Nigeria75/1株(HQ197753.1)同源性僅為92.8%(圖2)。

圖2 PPRV-F基因核苷酸同源性分析

2.4 不同毒株P(guān)PRV-F基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank下載不同毒株的PPRV-F基因序列，與本試驗(yàn)獲得的PPRV-F基因一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，寧夏獲得的PPRV-F基因與中國其他省份分離的8個毒株及印度、蒙古等國報道的7個毒株在同一個分支上，同屬譜系Ⅳ(圖3)。

2.5 PPRV-F基因編碼的氨基酸序列分析及F蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SMART和ExPASY進(jìn)行在線分析PPRV-F基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該基因編碼546個氨基酸，分子質(zhì)量為59.2 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為8.71；不穩(wěn)定系數(shù)是36.6，小于閾值40，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)109.98，總平均疏水指數(shù)0.201。SignalP4.0在線預(yù)測分析表明，PPRV-F蛋白有信號肽存在，為分泌型蛋白(圖4)。TMHMM2.0預(yù)測分析表明，F(xiàn)蛋白有跨膜區(qū)(圖5)。Jpred 3(http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred)在線分析發(fā)現(xiàn)，PPRV F蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋(H)占43.22%，β折疊(E)占20.5%，無規(guī)則卷曲占36.26%(圖6)。Phyre2三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，PPRV-F蛋白與其他麻疹病毒屬成員融合蛋白結(jié)構(gòu)相似(圖7)。

3 討論

PPR多流行于非洲和亞洲，并且在一些新的地區(qū)不斷有該病的報道[7]，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病于1942年首次在科特迪瓦暴發(fā)，目前已擴(kuò)散到亞洲、非洲的40余個國家。近年來，小反芻獸疫逐漸跨越地理屏障，擴(kuò)散趨勢不斷上升，我國周邊國家，如阿富汗、印度、尼泊爾等也都有PPR流行的報道[8]。2007年，我國西藏地區(qū)發(fā)生第一起PPR疫情，2008年-2010年在西藏先后3次發(fā)生PPR疫情[9-10]。

圖3 PPRV-F基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 PPRV-F蛋白的信號肽預(yù)測結(jié)果

從2013年底開始，國內(nèi)20多個省份先后暴發(fā)了小反芻獸疫疫情，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11-13]。2014年，寧夏出現(xiàn)首例PPR疫情[14]，2016年再發(fā)生一起輸入型PPR疫情，在處置該疫情的過程中，通過發(fā)病山羊的臨床癥狀及剖檢變化初步判定為PPR感染，但仍需通過分子生物學(xué)檢測進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本中心將發(fā)病山羊的病料帶回實(shí)驗(yàn)室，置-70℃保存?zhèn)溆?。本試?yàn)以該疑似PPR樣品為試驗(yàn)材料，提取樣品RNA，經(jīng)一步法RT-PCR擴(kuò)增，成功獲得PPRV-F基因，大小為1 641 bp，編碼546個氨基酸，分子質(zhì)量大約為59.2ku，這與趙文姬報道的西藏分離株特性相一致[15]。

圖5 PPRV-F蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果

圖6 PPRV-F蛋白的二級結(jié)構(gòu)示意圖

研究發(fā)現(xiàn)，對PPRV-F基因核苷酸序列進(jìn)行分析，不同地區(qū)來源毒株譜系不同。其中Ⅰ系主要來源塞內(nèi)加爾和尼日利亞的毒株，Ⅱ系為幾內(nèi)亞和科特迪瓦的毒株，Ⅲ系主要包括埃塞俄比亞、也門、蘇丹毒株，Ⅳ系均為亞洲毒株[16]。通過對F基因核苷酸序列進(jìn)行分析，可以為該病毒在不同地理區(qū)域間的傳播情況提供線索[17-18]。本試驗(yàn)獲得的寧夏PPRV-F基因與國內(nèi)其他省份報道的F基因序列高度同源，并且同屬譜系Ⅳ，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，該基因與我國其他地區(qū)分離到的PPRV毒株及印度、蒙古等國7個毒株在同一個分支上，與之前的報道相符[19-21]。

當(dāng)前應(yīng)用在PPR防控計(jì)劃中的小反芻獸疫疫苗為弱毒苗，免疫效果有效。但是，弱毒苗無法鑒別免疫抗體和野毒感染抗體，這在一定程度上影響了疫病的診斷。在疫病的有效防控和非疫區(qū)申報過程中，疫病暴發(fā)后的血清學(xué)檢測是一種重要的手段，為了便于血清學(xué)監(jiān)測，疫苗免疫后的同步檢測是關(guān)鍵。因此，盡管現(xiàn)在的弱毒苗可以有效的預(yù)防該病，但是為了便于血清學(xué)的監(jiān)測，標(biāo)記疫苗更有發(fā)展前景。PPRV-F蛋白可幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，可促使病毒囊膜和細(xì)胞膜融合。一旦病毒結(jié)合到宿主細(xì)胞的靶位，F(xiàn)蛋白就調(diào)節(jié)病毒膜和細(xì)胞膜的融合性，并允許釋放的N蛋白進(jìn)入細(xì)胞漿。在病毒感染過程中，新合成的F蛋白可使細(xì)胞間發(fā)生融合，具有很好的候選疫苗潛力[19-21]。當(dāng)前已經(jīng)有學(xué)者通過基因工程手段去除了該基因的信號肽和跨膜區(qū)，構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了表達(dá)，表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性[22-23]，但是并未對該蛋白做進(jìn)一步的研究，因此下一步擬研究蛋白的生物學(xué)功能，為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。