周炳坤，王博，賀情情，黃孝東，陳俊宇，黃健*

膀胱癌是男性泌尿系統(tǒng)中第二高發(fā)的惡性腫瘤，易于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［1，2］。對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者而言，以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療是首選的治療方式。但對(duì)于不適于鉑類(lèi)化療或化療無(wú)效者，免疫治療是主要的治療手段［3］。免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）治療是新興的免疫治療方式，其療效在多種惡性腫瘤中得到驗(yàn)證［4］。雖然ICB 治療可改善晚期膀胱癌患者的預(yù)后［5］，但多項(xiàng)膀胱癌ICB 治療的臨床試驗(yàn)表明其客觀緩解率僅為17.4%～24%［6，7］，且ICB 治療有效或抵抗的機(jī)制尚不完全清楚。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是由腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)組成［8］。TME 中各種組分間相互作用網(wǎng)絡(luò)可影響腫瘤進(jìn)展和免疫治療療效［9，10］。研究表明TME 中多種細(xì)胞組分與腫瘤進(jìn)展相關(guān)［11-13］，其中細(xì)胞毒性T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和NK 細(xì)胞等還與ICB 治療療效相關(guān)［14-16］。據(jù)報(bào)道，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）可通過(guò)重塑細(xì)胞外基質(zhì)和形成免疫抑制性TME 等機(jī)制［17］，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移以及治療抵抗［18，19］。但目前具體的TME 組成和膀胱癌免疫治療療效的關(guān)系尚不完全明確，且免疫治療研究缺乏可靠的能模擬人膀胱癌TME 的動(dòng)物模型，限制了對(duì)其機(jī)制的深入理解。

本研究首先通過(guò)IMvigor210 臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析，鑒定了與ICB 治療療效相關(guān)的差異基因、基因富集通路和細(xì)胞類(lèi)型；進(jìn)一步應(yīng)用TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集和免疫組化分析差異細(xì)胞與膀胱癌預(yù)后和進(jìn)展的關(guān)系；最后我們建立了N-butyl-N-（4-hydroxybutyl）-nitrosamine（BBN）誘 導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱成瘤模型，初步評(píng)估了該模型與人膀胱癌組織的TME 的組分特征。

1 資料與方法

1.1 臨床和數(shù)據(jù)資料搜集

本研究所使用的32 例膀胱癌患者組織均來(lái)自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，經(jīng)病理診斷為膀胱癌，實(shí)驗(yàn)遵循赫爾辛基宣言并獲得中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（SYSEC-KY-KS-2018-064）。病理組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后切成4 μm 切片。膀胱癌PD-L1 臨床試驗(yàn)IMvigor210數(shù) 據(jù) 集［20］從http：//research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies/packageVersions/下載和TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集從https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/下載。

1.2 差異基因分析

晚期膀胱癌患者接受PD-L1 阻斷治療后的臨床反應(yīng)類(lèi)型分為四類(lèi)，包括：治療有效組的完全緩解（complete response，CR）和部分緩解（partial response，PR）；治療無(wú)效組的疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）。IMvigor210 數(shù)據(jù)集總計(jì)有348 例晚期膀胱癌患者，排除臨床數(shù)據(jù)或基因表達(dá)數(shù)據(jù)不完整的病例后，共有298 例患者被納入研究，其中有效組68 例，無(wú)效組230 例。使用“DESeq2”R 包篩選治療有效組對(duì)比治療無(wú)效組的差異基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為|Log2（Fold Change）|≥1.0，同時(shí)滿(mǎn)足校正P值＜0.05。利用“ggpubr”R 包進(jìn)行可視化展示。

1.3 GO 和KEGG通路富集

采用R 包“clusterProfiler”、“DOSE”、“GO.db”和“topGO”進(jìn)行差異基因的富集分析。GO（Gene ontology）與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析中，校正P值（adjustedP）均小于0.05。GO 分析和KEGG 富集分析均對(duì)排名前20的通路進(jìn)行可視化展示，其中KEGG 通路圓點(diǎn)越紅表示越顯著，越大表示富集的差異基因越多。

1.4 腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞組分分析

采用“IOBR”R 包對(duì)PD-L1 治療有效組對(duì)比治療無(wú)效組的腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞組分基因集進(jìn)行分析［21］。基因集條目后綴為該基因集的具體引用出處。可視化使用“ComplexHeatmap”R 包（部分腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞分析中的基因集條目相同）。應(yīng)用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并以箱式圖展示。

1.5 膀胱癌預(yù)后及病理分期分析

使用CIBERSORT 在TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集中對(duì)活化NK 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞基因集與患者總生存時(shí)間進(jìn)行分析。排除含不完整基因表達(dá)量和臨床信息的數(shù)據(jù)后，408 例患者被納入分析。采用“Survminer”R 包計(jì)算細(xì)胞分?jǐn)?shù)與總生存期間的最佳閾值并將患者分成高低表達(dá)組，以Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，使用Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？梢暬褂谩癈omplexHeatmap”R 包。TCGA 中PDGFRB 表達(dá)量與總生存期分析由Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot.com/，僅收錄405 例膀胱癌患者數(shù)據(jù)，缺少3 例生存期為0 的患者數(shù)據(jù)）完成。細(xì)胞標(biāo)記基因與膀胱癌病理分期關(guān)系由GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）中stage plot 模塊完成分析。

1.6 構(gòu)建BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱腫瘤模型

參考Miyamoto H 等構(gòu)建BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱腫瘤模型［22］。用含0.05% BBN（N-butyl-N-（4-hydroxybutyl）-nitrosamine，麥克林，China）的飲用水飼養(yǎng)6～8 周齡C57BL/6 小鼠，每組6～10 只。從第12 周開(kāi)始每隔1～2 周收獲膀胱組織，組織固定在10%甲醛中，經(jīng)石蠟包埋保存。切取4 μm 厚度組織進(jìn)行H&E 染色以明確尿路上皮病變程度，根據(jù)尿路上皮是否發(fā)生異型性改變及其局部浸潤(rùn)程度，將膀胱病變分為正常、異型性增生、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）四類(lèi)。

1.7 H&E 染色

石蠟切片經(jīng)高溫烘烤1～2 小時(shí)后，依次通過(guò)二甲苯、無(wú)水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精和純水進(jìn)行脫蠟和水合，再經(jīng)蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)。

1.8 免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)烘烤、脫蠟和水合處理后，使用1%H2O2室溫處理10 min 以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，使用5% BSA 溶液室溫處理30 min 以封閉蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)，于4 ℃孵育一抗過(guò)夜，第二天于37℃孵育二抗30 min，然后進(jìn)行DAB 顯色和蘇木素染色。最后在正置顯微鏡下拍照觀察。一抗信息如下：人鼠α-SMA（1∶600，Cell signaling technology，USA）、人鼠PDGFRB（1∶800，Cell signaling technology，USA）、人NCR1（1∶1000，Abcam，USA）、鼠NCR1（1∶1000，Abcam，USA）、人CD8（1∶1000，中杉金橋，China）和鼠CD8（1∶800，Cell signaling technology，USA）。PDGFRB 組化評(píng)分采用以下標(biāo)準(zhǔn)：將DAB 染色強(qiáng)度按0、+1、+2 和+3 賦值0、1、2 和3 分，染色范圍按0、0%～24%、25%～49%、50%～74%和75%～100%分別賦值0、1、2、3 和4 分。兩者相乘即為該視野的組化評(píng)分，三個(gè)不同200X視野的平均組化評(píng)分即為該例患者的PDGFRB 組化評(píng)分。NCR1 采用定量分析，使用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取三個(gè)200X 視野的平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

R 版本為4.1.1（https：//www.r-project.org/）。腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞組分的統(tǒng)計(jì)分析采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，生存曲線(xiàn)比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，NCR1 的組化定量分析和細(xì)胞標(biāo)記基因與病理分期分析均采用one-way ANOVA，PDGFRB 的組化半定量分析采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，*為P＜0.05，**為P＜0.01，***為P＜0.001

2 結(jié) 果

2.1 篩選差異基因和富集分析

為了篩選IMvigor210 數(shù)據(jù)集中與免疫治療療效相關(guān)的差異基因（DEGs），我們首先利用“DESeq2”R 包進(jìn)行分析。以|log2Fold change|≥1.0，校正P值＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。有效組（CR/PR）對(duì)比無(wú)效組（SD/PD），分析結(jié)果顯示：共有521 個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，其中401 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，120 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1A）。

我們進(jìn)一步應(yīng)用“clusterProfiler”算法分析差異基因富集的GO 通路，其中包括生物過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞組成（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF），并對(duì)排名前20 的富集通路進(jìn)行可視化展示。BP（圖1B）中DEGs 主要富集在多種酶的調(diào)節(jié)通路如肽鏈內(nèi)切酶活性負(fù)調(diào)控（negative regulation of endopeptidase activity）等和體液免疫通路如體液免疫反應(yīng)（humoral immune response）等，提示治療有效患者中適應(yīng)性免疫應(yīng)答尤其是體液免疫應(yīng)答水平更高。對(duì)CC（圖1C）的分析顯示DEGs 主要富集在多種細(xì)胞器腔如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen）等，其中44 個(gè)DEGs 富集在含膠原細(xì)胞外基質(zhì)（collagen-containing extracellular matrix），提示成纖維細(xì)胞與免疫治療療效有關(guān)。我們對(duì)該通路中排名前20 的表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行了標(biāo)注（圖1A）。此外，DEGs 還富集在攻膜復(fù)合物（membrane attack complex，MAC），表明治療有效患者體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)激活水平更高。DEGs 在MF（圖1D）中主要富集在多種酶活性通路，如絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性（serine-endopeptidase activity）等，說(shuō)明ICB 治療中多種酶活性發(fā)生了改變。KEGG 通路富集分析（圖1E）發(fā)現(xiàn)：排名前三位的富集通路分別為神經(jīng)活性配受體互作（Neuroactive ligandreceptor interaction）、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)（Complement and coagulation cascades）和藥物代謝細(xì)胞色素P450（Drug metabolism-cytochrome P450），說(shuō)明這三條通路在ICB 治療中可能發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

圖1 IMvigor210 數(shù)據(jù)集差異基因和富集分析 A：IMvigor210 治療有效組與無(wú)效組間差異基因火山圖；B：排名前20 的生物過(guò)程（BP）通路；C：排名前20 的細(xì)胞組成（CC）通路；D：排名前20 的分子功能（MF）通路；E：排名前10 的KEGG 通路

2.2 TME 和細(xì)胞組分分析

為了鑒定與ICB 治療療效相關(guān)的TME 組分，我們利用“IOBR”R 包對(duì)有效組與無(wú)效組間的TME 相關(guān)基因集表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析，其中包括腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因集和免疫細(xì)胞相關(guān)基因集。如圖2A 和圖2C 所示，在有效組中組蛋白（Histones）、細(xì)胞周期（Cell cycle）等腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因集的表達(dá)水平高，提示腫瘤細(xì)胞自身特性影響ICB 治療療效。有效患者中CD8+T 細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞（Cytotoxic cells）和NK 細(xì)胞基因集表達(dá)的水平高，而肥大細(xì)胞（Mast cells）基因集的表達(dá)水平低，提示TME 中的免疫細(xì)胞在ICB 治療中可能發(fā)揮不同功能。

為了研究與免疫治療療效相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型，我們使用“IOBR”R 包對(duì)TME 中的NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）、巨噬細(xì)胞（Macrophage）和中性粒細(xì)胞（Neutrophil）以及非免疫細(xì)胞的CAFs 等進(jìn)行了分析（圖2B），發(fā)現(xiàn)主要有3 類(lèi)細(xì)胞的基因集表達(dá)水平與療效相關(guān)，包括NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞以及CAFs。有效組中（圖2C和2D），NK 細(xì)胞（P＜0.01）和CD8+T 細(xì)胞（P＜0.05）基因集表達(dá)的水平高；炎癥性腫瘤相關(guān)成纖維 細(xì)胞（inflammatory cancer-associated fibroblasts，iCAFs）基因集表達(dá)的水平低（P＜0.05，圖2E）。因此，膀胱癌TME 中與ICB 治療療效相關(guān)的差異細(xì)胞主要為效應(yīng)性的NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和間質(zhì)中的CAFs。

圖2 腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞組分分析 A：腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因集熱圖；B：腫瘤微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞基因集熱圖；C：部分基因集箱式圖統(tǒng)計(jì)方法：Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，*為P＜0.05，**為P＜0.01，***為P＜0.001

2.3 差異細(xì)胞與膀胱癌預(yù)后及病理分期分析

為了研究上述差異細(xì)胞與膀胱癌預(yù)后及病理分期的關(guān)系，我們利用CIBERSORT 計(jì)算TME 中活化NK 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞分?jǐn)?shù)并采用“Survminer”R 包計(jì)算細(xì)胞分?jǐn)?shù)與患者總生存期間的最佳閾值。在TCGA 數(shù)據(jù)集中，按最佳閾值0.13將408 例患者分為活化NK 細(xì)胞基因集高表達(dá)組（n=309）和低表達(dá)組（n=99），生存分析提示活化NK 細(xì)胞基因集的表達(dá)水平與膀胱癌患者總生存期呈正相關(guān)（圖3A，P=0.0011）。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)按最佳閾值0.16 將患者劃分成CD8+T 細(xì)胞高表達(dá)組（n=287）和低表達(dá)組（n=121），如圖3D 所示，CD8+T 細(xì)胞基因集高表達(dá)組的預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)組（P=0.00012）。如圖3C 所示，PDGFRB 基因表達(dá)量與膀胱癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（P=0.00089）。結(jié)果提示NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和PDGFRB 與膀胱癌患者的生存預(yù)后相關(guān)。

我們進(jìn)一步分析差異細(xì)胞與膀胱癌病理分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞標(biāo)記物CD56（圖3D，P＜0.001）以及CAFs 標(biāo)記物PDGFRB（圖3F，P＜0.0001）與膀胱癌病理分期呈正相關(guān)，而CD8+T 細(xì)胞標(biāo)記物CD8A 在不同期患者中的表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖3E，P=0.0934）。綜上所述，NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和CAFs 與膀胱癌預(yù)后相關(guān)，NK 細(xì)胞和CAFs 與膀胱癌病理分期相關(guān)。

圖3 差異細(xì)胞與膀胱癌預(yù)后及病理分期分析 A：活化NK 細(xì)胞基因集與膀胱癌總生存期分析；B：CD8+ T 細(xì)胞基因集與膀胱癌總生存期分析；C：PDGFRB 基因與膀胱癌總生存期分析（Kaplan Meier plotter）；D：CD56 與膀胱癌病理分期；E：CD8A 與膀胱癌病理分期；F：PDGFRB 與膀胱癌病理分期

2.4 膀胱癌組織中CD8+ T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和CAFs的免疫組化分析

我們前期研究結(jié)果顯示癌巢中CD8+T 細(xì)胞在低分期膀胱癌組織中高浸潤(rùn)［23］。本研究中我們又利用免疫組化對(duì)NK 細(xì)胞和CAFs 與膀胱癌病理分期的關(guān)系進(jìn)行了細(xì)胞水平驗(yàn)證。如圖4A 所示，將PDGFRB 染色強(qiáng)度分為0 到+3 四個(gè)等級(jí)。如圖4B所示，半定量分析結(jié)果提示PDGFRB+CAFs 在不同期膀胱癌中浸潤(rùn)程度不同，其在Ⅲ期患者組織中浸潤(rùn)程度高于Ⅱ期患者（P＜0.05），也高于Ⅰ期患者（P＜0.01）。對(duì)NCR1+NK 細(xì)胞進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞浸潤(rùn)水平與膀胱癌病理分期無(wú)關(guān)（圖4C，P=0.5334）。綜上所述，TME 中CD8+T 細(xì)胞與膀胱癌病理分期呈負(fù)相關(guān)，CAFs 與膀胱癌病理分期呈正相關(guān)。

圖4 膀胱癌組織驗(yàn)證 A：PDGFRB 染色強(qiáng)度分類(lèi)；B：PDGFRB 在不同分期膀胱癌中的浸潤(rùn)水平（Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)）；C：NCR1 在不同分期膀胱癌中的浸潤(rùn)水平（One-way ANOVA）比例尺為100 μm，*為P＜0.05，**為P＜0.01

2.5 BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱腫瘤與人膀胱癌組織結(jié)構(gòu)和浸潤(rùn)免疫細(xì)胞比較

上述生物信息學(xué)分析提示了與ICB 治療療效相關(guān)的信號(hào)通路、TME 組分以及細(xì)胞類(lèi)型。接著我們通過(guò)BBN 連續(xù)飼養(yǎng)小鼠并構(gòu)建自發(fā)小鼠膀胱成瘤模型。我們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)收獲膀胱組織，H&E 染色發(fā)現(xiàn)四種主要的尿路上皮病理類(lèi)型（圖5A），包括正常尿路上皮（Normal）、異型性增生（Dysplasia）、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（MIBC）。我們將正常尿路上皮和異型性增生定義為非腫瘤病變（Non-tumor），NMIBC 和MIBC 定義為腫瘤病變（Tumor）。H&E染色結(jié)果提示：隨著B(niǎo)BN 飼養(yǎng)時(shí)間的增加，膀胱腫瘤發(fā)生率保持上升趨勢(shì)，第25 周以后，腫瘤發(fā)生率為100%（圖5B）；從第19 周開(kāi)始MIBC 類(lèi)型比例逐步增加（圖5C）。在H&E 染色中，我們發(fā)現(xiàn)BBN小鼠膀胱腫瘤和人膀胱癌組織中的間質(zhì)組分具有相似的分布（圖5D）。利用連續(xù)切片，我們對(duì)人和BBN 小鼠膀胱腫瘤組織進(jìn)行了免疫組化染色，定性分析發(fā)現(xiàn)α-SMA+或PDGFRB+CAFs、CD8+T 細(xì)胞以及NCR1+NK 細(xì)胞在人和小鼠組織中的浸潤(rùn)表型相似（圖5D）。綜上所述，BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱腫瘤與人膀胱癌在疾病進(jìn)展、間質(zhì)分布和細(xì)胞浸潤(rùn)上具有一定相似性。

圖5 BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱腫瘤與人膀胱癌組織結(jié)構(gòu)和免疫組成比較 A：四種病理類(lèi)型的代表圖，正常尿路上皮（Normal）、異型性增生（Dysplasia）、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（MIBC）；B：小鼠膀胱成瘤率；C：膀胱病理類(lèi)型頻率分布；D：人膀胱癌（BLCA）和BBN 腫瘤（BBN tumors）中α-SMA+或PDGFRB+CAFs、CD8+ T 細(xì)胞和NCR1+NK 細(xì)胞的代表圖40 ×代表圖比例尺為500 μm，200 ×比例尺為100 μm，放大視野為400 ×

3 討 論

膀胱癌中PD-1/PD-L1 阻斷治療具有一定療效，但多數(shù)患者無(wú)法從中獲益，TME 是影響其治療療效的關(guān)鍵因素，目前TME 組分如何影響免疫治療療效的機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析和免疫組化鑒定了NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和CAFs 與膀胱癌患者免疫治療療效和生存預(yù)后、病理分期的相關(guān)性，建立了可用于評(píng)估TME 的自發(fā)小鼠膀胱成瘤模型，為加深理解免疫治療的機(jī)理提供了新思路。

CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)最主要的效應(yīng)性細(xì)胞，但其在腫瘤進(jìn)展和免疫治療中的作用各不相同［24，25］。有研究對(duì)25 種腫瘤的TME浸潤(rùn)細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)CD8+T 和NK 細(xì)胞在不同腫瘤中的預(yù)后意義不同，例如在乳腺癌中CD8+T細(xì)胞和NK 細(xì)胞均與患者預(yù)后呈正相關(guān)，而在肺腺癌中與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［26］。CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤患者預(yù)后及病理分期相關(guān)，有研究表明CD8+T 細(xì)胞在卵巢癌和胃癌內(nèi)浸潤(rùn)越多，患者總生存時(shí)間越長(zhǎng)［27，28］；CD8+T 細(xì)胞在低分期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中浸潤(rùn)更多［29］，但其在乳腺癌中與腫瘤高分級(jí)呈弱正相關(guān)［30］。CD8+T 細(xì)胞缺乏的“冷”腫瘤從免疫治療中獲益明顯低于CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)程度高的“熱”腫瘤［31］。CD8+T 細(xì)胞在TME 中的組織分布也會(huì)影響其預(yù)后意義，卵巢癌和食管癌中的研究表明腫瘤癌巢內(nèi)浸潤(rùn)的CD8+T 細(xì)胞而非間質(zhì)內(nèi)CD8+T細(xì)胞與患者預(yù)后呈正相關(guān)［32，33］，而Chen 等報(bào)道膀胱癌中瘤內(nèi)浸潤(rùn)的CD8+T 細(xì)胞與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)［34］。黑色素瘤PD-1 阻斷治療前，TME 中預(yù)存的CD8+T 細(xì)胞對(duì)治療時(shí)腫瘤消退至關(guān)重要［15］。其次ICB 治療療效也與腫瘤抗原負(fù)荷相關(guān)，腫瘤特異性CD8+T 細(xì)胞在啟動(dòng)階段需要MHC-Ⅰ類(lèi)分子呈遞的腫瘤抗原［35］。在免疫治療療效預(yù)測(cè)模型中，CD8+T 細(xì)胞是PD-1/PD-L1 阻斷治療最佳的的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)［36，37］。機(jī)制上，ICB 治療依賴(lài)于T 細(xì)胞耗竭狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)和干細(xì)胞樣腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的增殖，其中TME 中TCF1+PD-1+CD8+T 細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，能夠介導(dǎo)免疫治療中CD8+T 細(xì)胞的增殖反應(yīng)［38］。多項(xiàng)研究也報(bào)道NK 細(xì)胞瘤內(nèi)浸潤(rùn)程度和功能狀態(tài)與患者預(yù)后相關(guān)［39，40］。NK細(xì)胞對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有免疫監(jiān)視作用，一項(xiàng)晚期胃癌的研究表明外周血中循環(huán)NK 細(xì)胞的數(shù)量與患者總生存期呈正相關(guān)［28］；而NK 細(xì)胞失活與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)［41］。NK 細(xì)胞在ICB 治療中是獨(dú)立于CD8+T 細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，可以解釋PD-1 阻斷治療對(duì)部分MHC-Ⅰ類(lèi)分子缺乏的腫瘤依然有效以及T 細(xì)胞反應(yīng)缺失時(shí)腫瘤仍能得到控制［42］。腫瘤外周NK 細(xì)胞激活狀態(tài)和瘤內(nèi)NK 細(xì)胞浸潤(rùn)程度均影響頭頸鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌ICB 治療的效果［43，44］；有研究表明NK 細(xì)胞與黑色素瘤患者PD-1 阻斷治療療效和患者總生存時(shí)間呈正相關(guān)，其分泌FLT3L 進(jìn)一步激活瘤內(nèi)DCs，NK-DCs 細(xì)胞軸是ICB 治療中的積極預(yù)后因素［45］。與這些結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞基因集高表達(dá)在膀胱癌免疫治療有效組中，且其在TCGA 數(shù)據(jù)集中提示良好的預(yù)后意義，但CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞在ICB 治療中的具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

CAFs 是TME中一類(lèi)重要的抑制性細(xì)胞［46］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)CAFs 可通過(guò)免疫抑制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［17］。本研究發(fā)現(xiàn)PDGFRB+CAFs 在高病理分期膀胱癌中浸潤(rùn)增加，且PDGFRB 基因高表達(dá)與膀胱癌患者不良預(yù)后相關(guān)，提示CAFs 與膀胱癌的預(yù)后及進(jìn)展相關(guān)。CAFs 被報(bào)道與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［47，48］。高表達(dá)PDGFRB 的CAFs 是影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［49］。機(jī)制上，CAFs 分泌的TGF-β 通過(guò)抑制免疫細(xì)胞功能和產(chǎn)生免疫抑制環(huán)境參與腫瘤進(jìn)展［50］。我們還發(fā)現(xiàn)PD-L1 治療無(wú)效組患者中iCAFs 基因集表達(dá)的水平高，提示CAFs 可能參與膀胱癌免疫治療抵抗。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)異常是PD-L1 阻斷治療失敗的最強(qiáng)預(yù)測(cè)因素［51］；TME 中CAFs 豐度與免疫治療療效相關(guān)［52］。CAFs 可分泌IL-6 和CXCL12 等募集并誘導(dǎo)髓系細(xì)胞分化為髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞（MDSCs），進(jìn)一步影響免疫治療療效［53］。CAFs 也可上調(diào)CD8+T 上CTLA-4 表達(dá)，影響其瘤內(nèi)浸潤(rùn)以抑制免疫治療反應(yīng)［54］。因此，加深理解CAFs 在膀胱癌中的免疫抑制機(jī)制并開(kāi)發(fā)相關(guān)靶向藥物具有重要的臨床意義。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪情_(kāi)展腫瘤發(fā)病機(jī)制和治療療效評(píng)估的重要方法［55］。膀胱動(dòng)物模型包括異位模型和原位模型等。皮下成瘤模型是最為常見(jiàn)的異位模型，其腫瘤惡性程度與細(xì)胞系種類(lèi)直接相關(guān)［56］。人源細(xì)胞多異體種植于免疫缺陷鼠上，適合于研究腫瘤細(xì)胞表型改變，但不適用于腫瘤免疫學(xué)研究。膀胱原位模型有多種構(gòu)建方式。常用的膀胱原位成瘤模型多通過(guò)小鼠經(jīng)尿道膀胱灌注或膀胱肌層內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞構(gòu)建，該模型有眾多改良方案，但其操作困難且成瘤率不一［57］。利用Ptenfl/flp53fl/fl基因工程小鼠可成功構(gòu)建與人相似的MIBC，進(jìn)展過(guò)程包括NMIBC 期、MIBC 期和轉(zhuǎn)移期，其分子分型接近于人basal-squamous 型膀胱癌，但該模型缺乏人膀胱癌的高負(fù)荷突變，價(jià)格昂貴，構(gòu)建周期長(zhǎng)［58，59］。BBN 是膀胱組織特異性的化學(xué)致癌物，其使用方法簡(jiǎn)單；BBN 誘導(dǎo)的小鼠膀胱成瘤效果好，具有完整的膀胱免疫屏障。我們利用BBN 誘導(dǎo)小鼠膀胱自發(fā)成瘤，初步結(jié)果顯示BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱腫瘤在疾病進(jìn)展、間質(zhì)分布和CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞以及CAFs 浸潤(rùn)上與人膀胱癌組織相似。與我們的結(jié)果一致，F(xiàn)antini D等報(bào)道BBN 小鼠膀胱腫瘤具有與人膀胱癌相似的高突變負(fù)荷，分子分型上接近于人basal 型膀胱癌，且其成瘤率高［60］。因此，BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱成瘤模型可做為膀胱癌免疫治療潛在的研究模型。

綜上所述，本研究初步鑒定了NK 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞與膀胱癌免疫治療療效呈正相關(guān)，而CAFs 與療效呈負(fù)相關(guān)。這些細(xì)胞類(lèi)群與膀胱癌患者的預(yù)后和/或病理分期相關(guān)。在BBN 誘導(dǎo)的自發(fā)小鼠膀胱腫瘤中，NK 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞以及CAFs 的浸潤(rùn)特征與人膀胱癌組織類(lèi)似，為進(jìn)一步開(kāi)展膀胱癌免疫治療機(jī)制研究提供了理論依據(jù)和動(dòng)物模型。