王培順，李淑琴，王巖，汪瑞，高希濤，王昭昕，周軍

隨著人們對(duì)甲狀腺疾病的新認(rèn)識(shí)、臨床病理診斷手段的進(jìn)步以及細(xì)針穿刺活檢的逐漸普及，甲狀腺癌發(fā)病率逐年增高，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）占所有甲狀腺癌的80%～90%［1］。雖然PTC 進(jìn)展緩慢且預(yù)后良好，但臨床上通過(guò)患者年齡、轉(zhuǎn)移程度、切除的完整性、局部浸潤(rùn)范圍等來(lái)評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后尚有不足之處［2，3］。近年來(lái)，分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RAS、BRAF 突變和RET/PTC 重排會(huì)導(dǎo)致有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的異常激活，從而導(dǎo)致PTC 進(jìn)展。其中，BRAF 突變是PTC 中最普遍的分子改變。因此，尋找抑制這些分子通路的靶向治療有望成為將來(lái)的一個(gè)治療方向［4，5］。本研究旨在探討B(tài)RAF V600E 突變對(duì)PTC 臨床過(guò)程的影響及其重要性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2019 年12 月在連云港市第一人民醫(yī)院甲乳外科接受手術(shù)治療的PTC 患者。本研究所有參與患者均得到本人或家屬的知情同意，并報(bào)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均接受手術(shù)治療，且病理確診為PTC；②有完整的術(shù)后病理組織標(biāo)本；③患者無(wú)甲亢病史，也未接受甲狀腺相關(guān)藥物治療；④有隨訪時(shí)間超過(guò)6 個(gè)月的完整資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤伴嚴(yán)重纖維化或鈣化，無(wú)法對(duì)其基因檢測(cè)；②18 歲以下的未成年患者。根據(jù)上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終選取符合標(biāo)準(zhǔn)的患者253 例。男69 例，女184 例。

1.2 研究方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集 數(shù)據(jù)收集包括性別、年齡、腫瘤位置（單側(cè)/雙側(cè)）、腫瘤大小、多灶性、包膜外侵犯、甲狀腺外擴(kuò)散、橋本氏病、淋巴結(jié)清掃（中央?yún)^(qū)/側(cè)區(qū)）和腫瘤（TNM）分期。根據(jù)（2017）美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第八版進(jìn)行TNM 分期。收集癌組織并分析BRAF V600E 突變的存在。

1.2.2 BRAF 基因檢測(cè) 手術(shù)切除的組織標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定及石蠟包埋。切取腫瘤組織，使用DNA 提取試劑盒（廈門艾德公司）提取DNA。應(yīng)用廈門艾德公司生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒（ARMS 法），完全按照其說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。提取癌組織的DNA 后，對(duì)BRAF 基因第15 號(hào)外顯子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)序，判斷有無(wú)BRAF 突變。BRAF V600E 突變檢測(cè)結(jié)果判斷：待測(cè)樣品的內(nèi)控HE（或VIC）信號(hào)應(yīng)升起；如待測(cè)樣本外控FAM 信號(hào)的每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）≥28，則樣本為陰性（野生型），如樣本的FAM信號(hào)Ct值＜28，則樣本為陽(yáng)性（突變型）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用例（比率）表示，計(jì)數(shù)資料間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。進(jìn)一步采用多因素Logistic回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTC 患者臨床特征及預(yù)后

253 例接受甲狀腺手術(shù)的PTC 患者中，平均年齡為44.6±10.1 歲（18～79）；腫瘤平均大小為1.7±0.8 cm（0.4～6.3 cm）；術(shù)前未發(fā)現(xiàn)肺或骨等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例?；颊咧?，實(shí)施單側(cè)甲狀腺全切加中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃76 例，雙側(cè)甲狀腺全切加雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃127 例，甲狀腺全切除加雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃加單側(cè)頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃32 例。25.3%的患者為雙側(cè)，38.3%的患者發(fā)現(xiàn)多發(fā)腫瘤，分別有18.6%（47/253）和2.0%的患者出現(xiàn)包膜外侵犯和甲狀腺外擴(kuò)散，22.1%的患者患有橋本氏病。所有患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為25.3%（64/253），包括25.3%中央?yún)^(qū)LNM 和16.2%側(cè)方LNM。最終病理分期中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ分別為97（38.3%）、64（25.3%）、56（22.1%）和36（14.2%）。

患者隨訪期8～32 個(gè)月，平均隨訪18 個(gè)月。隨訪期間無(wú)死亡病例，無(wú)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移病例。

2.2 BRAFV600E 突變患者的臨床病理特征

253 例甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF 基因突變?yōu)?05 例，BRAF 基因突變率為81%。單因素分析顯示，年齡＞45 歲患者的基因突變率明顯大于年齡≤45歲患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見(jiàn)表1）。進(jìn)一步將年齡分層（小于25 歲，25～35 歲，35～45 歲，45～55 歲，大于55 歲），結(jié)果顯示BRAF 突變率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。BRAF 突變率在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和臨床分期Ⅰ、Ⅱ期組和Ⅲ、Ⅳ期組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與性別、是否合并橋本氏病、家族史、腫瘤大小、是否侵犯血管、包膜外侵等臨床特征無(wú)明顯相關(guān)性（見(jiàn)表1）。BRAF 突變率在有無(wú)頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與有無(wú)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃無(wú)明顯相關(guān)性（見(jiàn)表1）。進(jìn)一步多因素Logistic 回歸分析顯示年齡≥45 歲、高腫瘤分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是BRAF 突變的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05）（見(jiàn)表3）。

表1 BRAF 突變檢測(cè)與PTC 臨床病理學(xué)特征的關(guān)系［n（%）］

表3 BRAF 突變檢測(cè)與PTC 臨床病理學(xué)特征的多因素Logistic 回歸分析

3 討 論

細(xì)針穿刺（fine-needle aspiration，F(xiàn)NA）細(xì)胞學(xué)檢查是甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性診斷的重要方法，基因檢測(cè)可協(xié)助提高確診率。BRAF在甲狀腺FNA基因檢測(cè)中研究得最多，BRAF 在PTC 中突變率較高，而在良性結(jié)節(jié)罕見(jiàn)突變，因此BRAF 成為PTC 非常重要的腫瘤標(biāo)志物。本文目的在于進(jìn)一步探究PTC 患者中BRAF 基因的突變率，及其與PTC 臨床病理特征的關(guān)系。限于病灶細(xì)針穿刺技術(shù)水平以及細(xì)胞學(xué)診斷水平等原因，細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查存在一定局限性，因此本文采用對(duì)術(shù)后病理標(biāo)本行基因檢測(cè)，提高了研究的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示BRAF 突變出現(xiàn)于81%的PTC 患者，而且BRAF 突變發(fā)生率隨著PTC 患者年齡的增長(zhǎng)而明顯增加。據(jù)報(bào)道，PTC 患者中BRAF 基因的突變率高達(dá)36%～83%［6］，而且由于各地碘攝取率的不同，尤其高發(fā)于亞洲國(guó)家［7］。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

表2 BRAF 突變與年齡的關(guān)系［n（%）］

本研究中，BRAF 基因突變的發(fā)生率隨著患者年齡增長(zhǎng)而增加，同樣符合既往研究［8］。最近的一篇報(bào)道中，同樣發(fā)現(xiàn)了BRAF 突變與年齡的相關(guān)性［9］，其中患者被分成5 個(gè)年齡段，BRAFV600E在≤25、26～35、36～45、46～55、＞55 歲患者中的突變率依次為55%、80%、85%、88%、90%。而且，這一現(xiàn)象同樣被發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸癌患者中［10］。

PTC 中存在多種基因的改變，包括BRAF 突變、RAS 突變、RET/PTC 重排等。其中，BRAF 突變?cè)赑TC 中最為常見(jiàn)。BRAF 突變激活MAPK 通路，從而引起細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化［11］。有研究認(rèn)為，BRAF 突變的PTC 患者往往腫瘤較大，容易侵犯包膜及血管，易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［12］。而且具有較高的病理分期，臨床上容易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差［13］。然而，也有不少研究得出相反的結(jié)論。例如Mitsutake等［14］研究發(fā)現(xiàn)BRAF 基因突變與PTC 的侵襲性并無(wú)顯著相關(guān)性。在本研究中，筆者通過(guò)比較在不同腫瘤大小、病理分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否包膜外侵及是否淋巴結(jié)清掃等患者中BRAF 的突變率，發(fā)現(xiàn)BRAF 突變的PTC 患者更容易出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且明顯增加頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃的概率。由于本團(tuán)隊(duì)僅在術(shù)中快速病理明確側(cè)方淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下，予以治療性頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃；而對(duì)于絕大多數(shù)PTC 患者，常規(guī)予以治療性或預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃。所以這也解釋了本研究結(jié)果中BRAF 突變率與側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃明顯相關(guān)（P＜0.05），而與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃無(wú)明顯相關(guān)性。而腫瘤大小、是否侵犯血管、包膜外侵等其他侵襲性臨床病理特征并未在本研究中表現(xiàn)出與BRAF突變率的明顯相關(guān)性。本研究多因素Logistic回歸分析顯示：年齡大于等于45 歲、高腫瘤分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是BRAF 突變的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05）。隨著年齡增長(zhǎng)，BRAF 更容易發(fā)生突變，從而導(dǎo)致腫瘤惡性程度增加，易于發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。較高年齡的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC 患者也因此具有較高的臨床分期。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示BRAF 在PTC 中有較高的突變率，有助于PTC 的臨床確診。BRAF 基因突變的PTC 具有較高的臨床分期，更容易出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加了頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃的概率，因此可以用來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤的惡性程度。限于本研究病例數(shù)相對(duì)較少，且為單中心研究，尚需多中心更大樣本量進(jìn)一步研究探索。