趙煒，羅曼莉

乳腺癌是目前全世界范圍內發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。盡管由于新輔助化放療的應用，乳腺癌患者5 年生存率略有升高，但統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在20 至59 歲的女性中，乳腺癌仍排在癌癥導致死亡的首位，同時，在60 歲以上女性人群中，其在癌癥死亡原因中的排位僅次于肺癌［1］。腫瘤耐藥、復發(fā)和轉移是導致惡性腫瘤患者死亡的重要原因，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示目前乳腺癌患者中40%會復發(fā)，其中10%～20%是局部復發(fā)，60%～70%是遠處轉移［2］。腫瘤干細胞是存在于惡性腫瘤中的一類具有強大的成瘤能力、自我更新能力和多向分化潛能的細胞，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥和復發(fā)轉移過程中起著不可忽視的作用［3］。尋找新的分子靶點對乳腺癌患者的治療及預后有著重要的臨床意義。

發(fā)生于蛋白絲/蘇-脯氨酸基序的磷酸化在蛋白調節(jié)細胞生長和轉化中起著重要作用。這些發(fā)生磷酸化的蛋白絲/蘇-脯氨酸基序存在順反兩種構型，而細胞中起著重要作用的激酶、磷酸酶等只能識別某種特異構型的底物［4］。肽基脯氨酰順反異構酶Pin1（Peptidylprolyl Cis/Trans Isomerase，NIMA-Interacting 1）則可催化磷酸化的該基序發(fā)生順反異構從而影響蛋白的細胞定位、活性、穩(wěn)定性及與其他蛋白的相互作用。這些被Pin1 調控的磷酸化蛋白的改變與細胞存活、凋亡、增殖、代謝、遷移、周期進展和腫瘤發(fā)展密切相關［5］。Pin1 在人類乳腺癌中過表達，它的過表達可導致細胞周期蛋白D1 的上調并協(xié)同促進乳腺上皮細胞的轉化，而抑制Pin1 則可抑制乳腺上皮細胞的轉化［6］。有研究顯示敲除Pin1 可有效抑制小鼠肝癌細胞增殖和腫瘤生長［7，8］。還有研究顯示抑制Pin1 表達能有效減少胃腫瘤干細胞，并抑制其自我更新和體內外致瘤能力，并且與這些表型相一致，Pin1 在生化上靶向上皮間質轉化和腫瘤干細胞中的多個信號分子和生物標志物［9，10］。

長非編 碼RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）指的是長度在200 個核苷酸以上、不編碼功能性蛋白質的RNA，其廣泛存在于基因組中［11］。LncRNA 的表達具有組織和時空特異性，且其在發(fā)揮作用時，不論是哪種形式，常常是調控某種功能相關的少數(shù)基因表達或幾個相關蛋白在具體細胞事件中的功能［12］。盡管lncRNA 在乳腺癌中的生物學作用及臨床意義仍尚未知，但已有研究顯示LncRNA ANCR 可以通過介導EZH2 的降解減弱乳腺癌的轉移能力［13］；此外，lncRNA AGAP2-AS1 在乳腺癌中表達上調，并與曲妥珠單抗耐藥相關［14］。由于此種對特定細胞功能的調控的高特異性，LncRNA 具有極高的成為高特異性低副作用的治療靶點的潛力，因此成為我們的主要實驗對象。

鑒于Pin1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究擬找尋與Pin1 特異性結合的lncRNA，并初步探索與Pin1 相互作用的lncRNA 對乳腺癌細胞增殖、遷移能力及腫瘤干細胞表型的影響，為尋找乳腺癌新的治療靶點提供了新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT549 購于ATCC。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和細胞轉染 所有細胞培養(yǎng)均使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件設置在37℃恒溫、5%CO2。轉染時取適量細胞種于六孔板中，待其處于對數(shù)生長期時，分別加入si-NC（陰性對照si-RNA）和si-lncPIL-1 與LipofectamineTM2000 的混合液，轉染48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 建立lncPIL-1 過表達細胞系 根據(jù)lncPIL-1全長序列設計引物，可通過NCBI 中的Gene 數(shù)據(jù)庫獲得基因序列，克隆到過表達載體pc DNA 3.1中，由此合成過表達質粒。將空載載體及過表達載體包裹成慢病毒后轉染細胞，使用嘌呤霉素對細胞進行篩選。

1.2.3 平板克隆 以適當?shù)募毎芏确N于六孔板中，在培養(yǎng)箱中孵育7 d 后，將培養(yǎng)液吸出，用PBS小心清洗1 次，用4%多聚甲醛固定10 min，去固定液后用0.005%龍膽紫染色15 min，然后去除染液，干燥后進行觀察。

1.2.4 Transwell 侵襲遷移實驗 消化計數(shù)細胞，用無血清1640 培養(yǎng)基重懸，下室加600 μL 血清，上室加100 μL 細胞懸液，每孔約10 000～15 000 細胞，1～2 h 后檢查小孔下是否有小氣泡，12～20 h 后取出上室，用棉球蘸PBS 輕輕擦洗上室5 次，用甲醇固定20 min，去除固定液后用結晶紫染色5 min，水洗3～5 次。在顯微鏡下拍攝至少三個隨機視野，對細胞進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.5 RNA 提取及qRT-PCR 檢測 用Trizol 提取RNA，使用Evo M-MLV 反轉錄試劑將其逆轉錄為cDNA，再用PCR 儀進行PCR 反應擴增，計算RNA的相對表達水平。lncPIL-1 引物序列為上游：5′TTTCCTGGCTGTTTTCCCCA3′；下 游：5′ACGAATGAGTGAACTCCTGGC3′。

1.2.6 RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）和紫外交聯(lián)免疫沉淀（CLIP）及深度測序 收集細胞后使用加入了蛋白酶抑制劑、EDTA 以及RNA 酶抑制劑的IP lysis buffer 裂解細胞。離心蛋白裂解液，取上清蛋白液，分作Flag 組、HA 組和IgG 組。加入磁珠預清洗30 min 后，分別加入Flag 抗體或HA 和IgG 抗體，室溫旋轉混合4h，然后加入磁珠，室溫旋轉混合2 h。磁力架上吸除上清，并用IP lysis buffer 洗滌磁珠。加入蛋白酶K 去除蛋白后，加Trizol LS 提取RNA，進行后續(xù)分析?？俁NA 送安諾基因公司進行Illumina 高通量測序。

做CLIP 實驗時，在裂解細胞前先進行紫外交聯(lián)，條件設置為254 nm 紫外線，150 mJ/cm2，40 s，后續(xù)步驟同上。

1.2.7 ALDEFLUOR 試劑分選ALDH1+細胞 消化獲取細胞，調整細胞濃度，加入5 μL Aldefluor 反應劑，充分混勻；取另一干凈EP管，加入5 μL Aldefluor反應抑制劑DEAB，將上述加了5 μL Aldefluor 反應劑的細胞懸液500 μL 加到該EP 管中，充分混勻，37 ℃水浴鍋中孵育40 min 后離心，加入200 μL Aldefluor 緩沖液，用流式細胞儀進行分選。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 9 軟件對本實驗所得結果進行統(tǒng)計學分析及繪圖，實驗結果的組間對比采用t檢驗，若P＜0.05 則認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 lncPIL-1 與Pin1 特異性結合并在乳腺癌細胞中高表達

為了檢測與Pin1 特異結合的lncRNA，我們首先在乳腺癌細胞MCF-7 內過表達Flag-Pin1 或HAPin1，分別使用Flag 和HA 的特異性抗體進行免疫沉淀實驗，獲得與Flag-Pin1 或HA-Pin1 結合的RNA，然后實施高通量測序即RIP-seq策略。通過對Flag-Pin1 或HA-Pin1 富 集到的RNA 與IgG 組對比，我們發(fā)現(xiàn)了一批與Pin1 存在相互作用的lncRNA，按其富集豐度排列選取排名前40 位的lncRNA 進行初步的探索（表1）。接下來我們做了進一步的RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗，通過qRT-PCR方法驗證（表2）。并進一步通過紫外交聯(lián)處理再進行免疫沉淀（CLIP），找尋與Pin1 直接結合的lncRNA（表3）。同時，我們查閱TANRIC 數(shù)據(jù)庫得到這些lncRNA 的生存曲線信息，如圖1 所示，Log-Rank 檢驗P 值小于0.05，說明高、低表達兩組生存曲線差異具有統(tǒng)計學意義，提示此lncRNA 與乳腺癌患者預后不良有著極高的相關性。因此，綜合考慮以上結果，我們選取這條lncRNA，將其命名為lncPIL-1（Pin1-interacting LncRNA-1），作為后續(xù)研究的主要對象。

表1 RNA 免疫沉淀聯(lián)合深度測序（RIP-seq）結果

表2 RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）聯(lián)合qRT-PCR 實驗結果

表3 紫外交聯(lián)免疫沉淀（CLIP）聯(lián)合qRT-PCR 實驗結果

圖1 乳腺癌患者lncPIL-1 的生存分析圖 淺色折線代表

2.2 lncPIL-1 在乳腺癌細胞系中的過表達和敲降效率

為了探究lncPIL-1 對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，我們在不同乳腺癌細胞系分別對lncPIL-1 進行了過表達和敲降處理。通過對乳腺癌細胞MDA-MB-231、BT549 進行慢病毒質粒轉染，我們得到了相應的lncPIL-1 過表達細胞株，通過qRT-PCR 檢測其過表達效率，顯示lncPIL-1 表達顯著上調，與對照組相比，分別上調了約3500、30 倍（圖2-A、B）。使用對照和lncPIL-1 siRNA 轉染乳腺癌細胞MDAMB-468、MCF-7，我們得到敲降細胞株，通過qPCR檢測顯示lncPIL-1 表達顯著下調，分別約下調為對照組的55%、25%（圖2-C、D）。

2.3 lncPIL-1 對乳腺癌細胞增殖無明顯影響

Pin1 對乳腺癌細胞生長有明顯的促進作用，為了探究lncPIL-1 是否也影響乳腺癌細胞的增殖能力，我們對乳腺癌細胞BT549 和MDA-MB-231 進行了平板克隆形成實驗。結果顯示與對照組相比，過表達lncPIL-1 細胞株的克隆數(shù)并無顯著增長（圖3），提示lncPIL-1 對乳腺癌細胞的增殖水平無明顯影響。

2.4 過表達lncPIL-1 可增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，反之亦然

Pin1 可促進乳腺癌細胞運動遷移，為了探究lncPIL-1 是否影響乳腺癌細胞的遷移能力，我們進行了Transwell 實驗。結果顯示在乳腺癌細胞MDAMB-231、BT549 中，與對照組相比，過表達lncPIL-1后穿過小室的乳腺癌細胞數(shù)明顯增多（圖4-A、B、D、E）。同時在乳腺癌細胞MDA-MB-468 中，與對照組相比，敲降lncPIL-1 后穿過小室的乳腺癌細胞數(shù)明顯減少（圖4-C、F）。提示過表達lncPIL-1會加強乳腺癌細胞的運動遷移能力，而敲降lncPIL-1 會降低乳腺癌細胞的遷移能力。

2.5 敲降lncPIL-1 抑制乳腺癌干性表型

圖4 Transwell 實驗檢測lncPIL-1 對乳腺癌細胞遷移能力的影響 A、B 分別為乳腺癌細胞MDA-MB-231、BT549 的對照組和lncPIL-1 過表達組經Transwell 實驗處理15 h、10 h 后的在顯微鏡下拍攝的圖片；D、E 為圖片中細胞數(shù)量的統(tǒng)計分析；C 為乳腺癌細胞MDA-MB-46 的對照組和3 個si-lncPIL-1 敲降組經Transwell 實驗處理15 h 后的在顯微鏡下拍攝的圖片；F 為圖片中細胞數(shù)量的統(tǒng)計分析

促進乳腺癌干細胞自我更新是Pin1 蛋白的重要功能之一，為了探究lncPIL-1 是否也影響乳腺癌干細胞的功能，我們利用ALDEFLUOR 試劑盒檢測富含乳腺癌干細胞的ALDH+細胞比例。分別使用陰性對照試劑DEAB 和Aldefluor 反應劑處理乳腺癌細胞MCF-7，然后進行流式細胞術分選ALDH+細胞，對結果進行統(tǒng)計學分析。與對照組相比，敲降lncPIL-1 后，ALDH+細胞數(shù)量明顯下降（圖5）。這提示敲降lncPIL-1 會抑制乳腺癌細胞干性表型。

圖5 流式細胞術分選ALDH1+細胞 A 為乳腺癌MCF-7 si-NC 和3 個si-lncPIL-1 敲降株經DEAB 處理后作為陰性對照組做流式分選后的圖像；B 為乳腺癌MCF-7 si-NC 和3 個si-lncPIL-1 敲降株作為實驗組經Aldefluor 反應劑處理后做流式分選后的圖像；C 為ALDH+細胞比例的統(tǒng)計分析

3 討 論

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展及轉移機制現(xiàn)仍未有準確的認知。大量研究證實，Pin1 在60 余種人惡性腫瘤中表達升高，其中20 余種惡性腫瘤中，30%的病例呈現(xiàn)高表達，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結腸癌中Pin1 過表達與患者的不良預后密切相關［15，16］。Pin1過表達于大多數(shù)人類乳腺癌中，其促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并對腫瘤干細胞的維護至關重要［17］。

以往對Pin1 與底物的相互作用的研究主要集中在蛋白層面［18］，為探索lncRNA 是否在Pin1 與底物的相互作用中起到指引、調控作用，本實驗中我們系統(tǒng)地研究和鑒定了與Pin1 結合的lncRNA，首先通過Pin1 的RNA 結合蛋白免疫沉淀獲取與Pin1 結合的lncRNA，并對這些RNA 進行測序（RIP-seq），初步獲得其信息。隨后，我們進一步進行了RIP 和CLIP 實驗去驗證這些lncRNA 與Pin1 的特異性結合能力，綜合考慮通過文獻找尋得到的其與乳腺癌患者不良預后的相關性的結果，我們選定了一條lncRNA 作為本實驗的研究對象，將其命名為lncPIL-1。我們建立了lncPIL-1 的敲降和過表達細胞系來研究其對腫瘤細胞功能的影響。通過平板克隆實驗，我們發(fā)現(xiàn)lncPIL-1 對乳腺癌細胞的增殖能力無明顯影響。這提示lncPIL-1 與Pin1 的功能途徑可能存在不同。通過Transwell 實驗，我們發(fā)現(xiàn)過表達lncPIL-1 后，乳腺癌細胞的侵襲遷移能力明顯增強，而敲降lncPIL-1 后，癌細胞的侵襲遷移能力明顯下降，這提示lncPIL-1 發(fā)揮功能可能與腫瘤的轉移有關。

腫瘤干細胞的存在是導致腫瘤治療失敗和轉移的主要原因之一［19，20］。已有研究表明，乳腺癌中Pin1 促進乳腺癌干細胞自我更新和致瘤能力［21，22］。目前認為三種干細胞標志物CD44、CD24和ALDH1 在預測包括轉移風險和總生存率在內的乳腺癌患者預后方面具有巨大的價值［23］。在本實驗中，為了探究lncPIL-1 與腫瘤干細胞的關系，我們進行了檢測腫瘤干性能力的ALDEFLUOR 實驗，結果顯示敲降lncPIL-1 后，ALDH+細胞數(shù)量明顯下降。這提示lncPIL-1 可能參與Pin1 調控乳腺癌干細胞的病理過程［24］。

綜上所述，長非編碼RNA lncPIL-1 與Pin1 特異性結合，在乳腺癌細胞中高表達，并與乳腺癌患者預后不良高度相關。在乳腺癌細胞MDA-MB-231、BT549 中，過表達lncPIL-1 不影響細胞生長，但會加強乳腺癌細胞的運動遷移能力，同時在乳腺癌細胞MDA-MB-468 中，敲降lncPIL-1 會降低乳腺癌細胞的運動遷移能力。在乳腺癌細胞MCF-7中，敲降lncPIL-1 明顯抑制乳腺癌細胞干性表型。這提示lncPIL-1 與Pin1 蛋白功能大致相似，但也存在差異，可能是Pin1 蛋白在促進腫瘤轉移和干性表型方面相互作用的lncRNA，是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要調控因子，有望成為乳腺癌新的治療靶點。