周琴飛，龔黎燕，鮑關(guān)愛，丁群芳，季晶晶

β-欖香烯對骨癌痛大鼠嗎啡耐受的影響及作用機制研究

周琴飛，龔黎燕*，鮑關(guān)愛，丁群芳，季晶晶

中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院），中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與腫瘤研究所罕見病及頭頸內(nèi)科，浙江 杭州 310022

研究β-欖香烯對骨癌痛大鼠嗎啡耐受的影響及作用機制。雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、嗎啡組及β-欖香烯低、高劑量（0.7、2.8 mg/kg）組和艾芬地爾（5 mg/kg）組，每組15只；對照組予以生理鹽水脛骨注射并ip二甲基亞砜，其余各組構(gòu)建骨癌痛-慢性嗎啡耐受模型后，分別ip相應(yīng)藥物，通過檢測機械撤退閾值和熱退潛伏期對各組大鼠進行疼痛行為學(xué)評估；采用qRT-PCR檢測各組大鼠脊髓組織腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，）、、μ阿片受體（μ opioid receptor，）、-甲基--門冬氨酸受體亞單位2B（-methyl--asparate receptor subunit 2B，）和環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，）的mRNA表達；采用Western blotting檢測各組大鼠脊髓組織NR2B、cAMP和MOPR的蛋白表達。分別采用不同質(zhì)量濃度（5、10、20、25 μg/mL）的β-欖香烯處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，采用CCK-8法檢測SH-SY5Y細(xì)胞活性，采用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，確定β-欖香烯作用于SH-SY5Y細(xì)胞的適宜質(zhì)量濃度；設(shè)置對照組、嗎啡組、β-欖香烯（5 μg/mL）組和艾芬地爾（10 μmol/L）組，對照組予以常規(guī)培養(yǎng)，其余各組采用10 μmol/L嗎啡作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h，以構(gòu)建嗎啡耐受細(xì)胞模型，而后β-欖香烯組和艾芬地爾組分別給予相應(yīng)藥物，采用qRT-PCR檢測、、、、和的mRNA表達，采用Western blotting檢測NR2B、cAMP和MOPR的蛋白表達。給藥第1天，相較于對照組，其余各組大鼠機械撤退閾值和熱退潛伏期明顯升高（＜0.001），隨給藥時間延長，嗎啡組機械撤退閾值和熱退潛伏期逐漸下降，各給藥組機械撤退閾值和熱退潛伏期明顯高于嗎啡組（＜0.05、0.01、0.001）。β-欖香烯顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞活性（＜0.001），且呈劑量和時間相關(guān)性；β-欖香烯對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)cAMP含量無明顯影響。嗎啡耐受可促進大鼠脊髓組織和SH-SY5Y細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NR2B及cAMP表達（＜0.001），抑制MOPR表達（＜0.001）；給予艾芬地爾或β-欖香烯后，則呈現(xiàn)相反趨勢（＜0.01、0.001），且β-欖香烯的作用呈劑量相關(guān)性。β-欖香烯具有一定的鎮(zhèn)痛作用，可通過調(diào)控MOPR/NR2B有效緩解骨癌痛大鼠嗎啡耐受。

β-欖香烯；骨癌痛；嗎啡耐受；μ阿片受體/-甲基--門冬氨酸受體亞單位2B；炎癥因子

骨癌痛是一種慢性頑固性癌痛，臨床多采用嗎啡等阿片類藥物治療，但長期使用嗎啡易產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，即嗎啡耐受，導(dǎo)致嗎啡鎮(zhèn)痛效果逐漸減弱甚至消失，需要增加嗎啡劑量才能獲得同等的鎮(zhèn)痛效果[1]。研究表明，μ阿片受體（μ opioid receptor，MOPR）是阿片類藥物發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用最主要因子，當(dāng)MOPR與阿片類激動劑結(jié)合時，其分子構(gòu)象發(fā)生改變，與G蛋白結(jié)合形成G蛋白-阿片受體復(fù)合物，可降低胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）等信號濃度，阻止痛覺沖動的傳導(dǎo)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[2]。但長期使用阿片類藥物的情況下，可引起MOPR蛋白磷酸化，導(dǎo)致MOPR脫敏，進而造成嗎啡耐受。因此，探尋改善患者嗎啡耐受的有效藥物及作用機制是骨癌痛臨床治療中亟待解決的問題，對骨癌痛患者預(yù)后的改善具有重要意義。

β-欖香烯是從天然中草藥姜科植物溫郁金Y.H.Chen et.Ling中提取獲得的萜烯類化合物，是該類中藥主要活性成分[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯作為非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物，具有選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖和提高免疫功能的“雙重效應(yīng)”[5]；此外，《中國藥典》記載郁金提取物可“治經(jīng)閉痛經(jīng)，胸腹脹痛，刺痛，熱病神昏，癲癇發(fā)狂，黃疸尿赤”[6]；《新華本草綱要》記載郁金提取物“治癥瘕積聚，氣血凝滯，脘腹脹痛，食積脹痛，經(jīng)閉腹痛等癥”[7]；可見郁金提取物除抗腫瘤作用外，還具有“止痛”的功效。另有研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯可能通過抑制-甲基--門冬氨酸受體亞單位2B（-methyl--asparate receptor subunit 2B，NR2B）表達，調(diào)節(jié)MOPR、cAMP等因子表達，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[8]。但目前β-欖香烯在骨癌痛患者嗎啡耐受改善方面的療效及具體作用機制仍有待研究。此外，艾芬地爾是一種-甲基--門冬氨酸（-methyl--asparate，NMDA）受體的拮抗劑，對NR2B亞基具有高度的選擇性。故在本研究中將艾芬地爾作為陽性對照藥物，探討β-欖香烯對骨癌痛大鼠嗎啡耐受的影響及作用機制，為骨癌痛的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠75只，6～8周齡，體質(zhì)量（250±15）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證號[SCXK（滬）0036875]。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，12 h/12 h明暗交替，溫度（20±2）℃，濕度40%～60%。動物實驗經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2020-110-003），遵循中國動物護理和機構(gòu)倫理指導(dǎo)方針。

1.2 細(xì)胞株

大鼠乳腺癌Walker 256細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自ICLC-IST細(xì)胞庫。

1.3 藥品與試劑

鹽酸嗎啡注射液（批號040203，國藥準(zhǔn)字H21022436，10 mg/mL）購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司；β-欖香烯（批號0408251，國藥準(zhǔn)字H20110114）購自大連石藥集團遠(yuǎn)大制藥有限公司；艾芬地爾（批號12892）購自美國Sigma-Aldrich公司；生理鹽水（1.5 mL/支，批號200801255，國藥準(zhǔn)字S10870001）購自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司；蛋白提取試劑盒（批號BC3710）購自北京索萊寶生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號AB102536）購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司；Trizol試劑（批號15596026）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號4374966）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑盒（批號ab228554）、MOPR一抗（批號ab5392）、NR2B一抗（批號ab254356）、cAMP一抗（批號ab76238）、β-actin一抗（批號ab8226）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號ab6721）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號ab205719）購自英國Abcam公司。

1.4 儀器

371型CO2培養(yǎng)箱、ST16R型高速冷凍離心機、Multiskan Fc型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYCZ-20E型電泳設(shè)備（北京六一生物科技有限公司）；LightCycler 96型qRT-PCR儀（羅氏集團）；熱輻射測痛儀、纖維絲測痛儀（美國ITC Life Science）。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

按照隨機數(shù)字表法將Wistar大鼠分為對照組、嗎啡組及β-欖香烯低、高劑量（0.7、2.8 mg/kg）組和艾芬地爾（5 mg/kg）組，每組15只。對照組予以生理鹽水脛骨注射，其余各組大鼠構(gòu)建骨癌痛-慢性嗎啡耐受模型[9]：首先進行大鼠骨癌痛模型建立，大鼠ip 7%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉后，腹部朝下，左側(cè)后肢先用10 mL注射器穿刺打孔，然后換10 μL微量移液器進入脛骨骨髓腔，緩慢注射3 μL Walker 256乳腺癌細(xì)胞懸液（3×103～3×104個），注射完畢后用骨蠟封住針孔，清潔創(chuàng)口，縫合肌肉皮膚；而后進行慢性嗎啡耐受模型建立，大鼠癌細(xì)胞接種術(shù)后10 d時，腰3～4椎間隙穿刺鞘內(nèi)置管，注射嗎啡（20 μL/kg），1次/d，連續(xù)10 d，大鼠在注射嗎啡10 d后形成較為穩(wěn)定的機械痛敏，標(biāo)志慢性嗎啡耐受模型建立成功。而后對照組、嗎啡組ip 200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），各給藥組ip溶于200 μL DMSO的相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)10 d。各組大鼠行為學(xué)測定完畢后，ip 2%戊巴比妥鈉深度麻醉后快速斷頭處死，于冰上取腰L4、L5段脊髓背角組織標(biāo)本。

2.2 疼痛行為學(xué)評估

大鼠建模成功后1～10 d，按照以下指標(biāo)觀察并記錄大鼠疼痛行為學(xué)變化。

2.2.1 機械撤退閾值檢測 將大鼠置于玻璃板小室中，放置于金屬篩網(wǎng)上，讓大鼠適應(yīng)環(huán)境10 min后，在安靜清醒的狀態(tài)下將刺激儀細(xì)纖維接觸大鼠左側(cè)足底中部，在5 s內(nèi)最大可追加至50 g力量，觀察大鼠縮爪反應(yīng)并記錄機械撤退閾值。

2.2.2 熱退潛伏期檢測 將大鼠置于玻璃板小室中，在安靜清醒的狀態(tài)下調(diào)整熱痛刺激儀光源焦距照射動物后肢掌心，記錄從照射到縮爪逃避的時間，即熱退潛伏期，每只大鼠測量5次，間隔時間5 min，上限20 s，以避免造成組織損傷。

2.3 qRT-PCR檢測大鼠脊髓背角組織腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、NR2B、cAMP和MOPR的mRNA表達

取各組大鼠脊髓背角組織，充分剪碎組織，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃預(yù)變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；40個循環(huán)。引物序列：上游引物5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物5’-CGCCAGTAGACTCCACGAC-3’；上游引物5’-TCCACA ATTA CICCTCGACG-3’，下游引物5’-TCCGATTCTTCTICTGAGCC-3’；上游引物5’-TGCTCCTGGCTCAACTTGTCC-3’，下游引物5’-GCGTGCTAGTGGCTAAGGCATCTG-3’；上游引物5’-AGGTCCTCAGCTACAAGGAAG-3’，下游引物5’-TCTTGAAGTCACAATCCTCTGGT-3’；上游引物5’-CACCGGCAAGGATTCCAA-3’，下游引物5’-CACTCAGGCATCGACATTCG-3’；上游引物5’-AGCCTTTGTCCTCTGCCAAGT-3’，下游引物5’-CCAGAATGTGCCACGGTTTT-3’；上游引物5’-TGTTCTCAGGGAGATCTTGGAAAT-3’，下游引物5’-CATCGCTGTTCATACAATCAGAATT-3’。

2.4 Western blotting檢測大鼠脊髓背角組織NR2B、cAMP和MOPR蛋白表達

采用蛋白提取試劑盒提取大鼠脊髓背角組織蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入NR2B（1∶1000）、cAMP（1∶50 000）、MOPR（1∶20 000）和β-actin（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶2000），孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.5 體外實驗

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞接種于含100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

2.5.2 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 SH-SY5Y細(xì)胞以3×104/mL接種至96孔板中，每孔100 μL，加入不同質(zhì)量濃度（5、10、20、25 μg/mL）的β-欖香烯，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細(xì)胞活性。

2.5.3 細(xì)胞內(nèi)cAMP含量檢測 SH-SY5Y細(xì)胞以3×104/mL接種至96孔板中，每孔100 μL，加入不同質(zhì)量濃度（5、10、20、25 μg/mL）的β-欖香烯，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，按照試劑盒說明書測定cAMP含量。

2.5.4 嗎啡耐受細(xì)胞模型的構(gòu)建及給藥 對照組予以常規(guī)培養(yǎng)，采用10 μmol/L嗎啡作用細(xì)胞48 h以構(gòu)建嗎啡耐受細(xì)胞模型[10]，同時，各給藥組分別加入β-欖香烯（5 μg/mL）和艾芬地爾（10 μmol/L），作用48 h。

2.5.5 qRT-PCR檢測細(xì)胞、、、、和的mRNA表達 按“2.5.4”項下方法處理細(xì)胞，按“2.3”項下方法提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。

2.5.6 Western blotting檢測細(xì)胞NR2B、cAMP和MOPR蛋白表達 按“2.5.4”項下方法處理細(xì)胞，按“2.4”項下提取蛋白，檢測NR2B、cAMP和MOPR蛋白表達。

2.6 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠疼痛行為學(xué)評估

如圖1所示，在構(gòu)建大鼠骨癌痛-慢性嗎啡耐受模型前（0 d），各組大鼠機械撤退閾值、熱退潛伏期無明顯差異；給藥第1天（1 d），相較于對照組，其余各組機械撤退閾值、熱退潛伏期明顯升高（＜0.001）；隨給藥時間延長，嗎啡組機械撤退閾值、熱退潛伏期逐漸下降，β-欖香烯低、高劑量組和艾芬地爾組機械撤退閾值、熱退潛伏期明顯高于嗎啡組（＜0.05、0.01、0.001）；至第10天（10 d），嗎啡組與對照組機械撤退閾值、熱退潛伏期比較無明顯差異，β-欖香烯低、高劑量組和艾芬地爾組機械撤退閾值、熱退潛伏期明顯高于嗎啡組（＜0.01、0.001），β-欖香烯高劑量組機械撤退閾值、熱退潛伏期高于β-欖香烯低劑量組，說明β-欖香烯和艾芬地爾均可有效改善大鼠嗎啡耐受，且β-欖香烯劑量增加，效果更優(yōu)。

3.2 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6、NR2B、cAMP和MOPR的mRNA和蛋白表達

如圖2-A、B所示，相較于對照組，嗎啡組大鼠脊髓組織、、、和mRNA表達水平明顯升高（＜0.001），mRNA表達水平明顯降低（＜0.001）；相較于嗎啡組，β-欖香烯低、高劑量組和艾芬地爾組脊髓組織、、、和mRNA表達水平明顯降低（＜0.01、0.001），mRNA水平明顯升高（＜0.001）。如圖2-C所示，相較于對照組，嗎啡組脊髓組織NR2B和cAMP蛋白表達水平明顯升高（＜0.001），MOPR蛋白表達水平明顯降低（＜0.001）；相較于嗎啡組，β-欖香烯低、高劑量組和艾芬地爾組脊髓組織NR2B和cAMP蛋白表達水平明顯降低（＜0.01、0.001），MOPR蛋白表達水平明顯升高（＜0.001）。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與嗎啡組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖2 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6、NR2B、cAMP和MOPR的mRNA(A、B) 和蛋白表達(C) (, n = 3)

3.3 不同濃度的β-欖香烯對SH-SY5Y細(xì)胞活性及cAMP含量的影響

采用不同質(zhì)量濃度的β-欖香烯處理正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，并采用CCK-8法檢測SH-SY5Y細(xì)胞活性，結(jié)果見圖3-A，β-欖香烯顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞活性（＜0.001），且呈劑量和時間相關(guān)性。因此，以5 μg/mL β-欖香烯作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h為最佳實驗條件。采用cAMP檢測試劑盒測定SH-SY5Y細(xì)胞cAMP含量，結(jié)果見圖3-B，β-欖香烯對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)cAMP含量無明顯影響。

3.4 β-欖香烯對嗎啡耐受細(xì)胞模型cAMP含量和TNF-α、IL-1β、IL-6、NR2B、cAMP和MOPR的mRNA和蛋白表達的影響

對照組予以常規(guī)培養(yǎng)，嗎啡組、β-欖香烯組、艾芬地爾組采用10 μmol/L嗎啡作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h，以構(gòu)建嗎啡耐受細(xì)胞模型，而后β-欖香烯組、艾芬地爾組予以β-欖香烯、艾芬地爾處理，采用cAMP檢測試劑盒進行各組細(xì)胞cAMP含量測定，如圖4-A所示，相較于對照組，嗎啡組cAMP水平明顯升高（＜0.001；相較于嗎啡組，β-欖香烯、艾芬地爾組cAMP水平明顯降低（＜0.001）。如圖4-B、C所示，相較于對照組，嗎啡組、、、和mRNA表達水平明顯升高（＜0.001），mRNA表達水平明顯降低（＜0.001）；相較于嗎啡組，β-欖香烯組、艾芬地爾組、、、和mRNA表達水平明顯降低（＜0.001），mRNA表達水平明顯升高（＜0.001）。如圖4-D、E所示，相較于對照組，嗎啡組NR2B和cAMP蛋白表達水平明顯升高（＜0.001），MOPR蛋白表達水平明顯降低（＜0.001）；相較于嗎啡組，β-欖香烯組、艾芬地爾組NR2B和cAMP蛋白表達水平明顯降低（＜0.001），MOPR蛋白表達水平明顯升高（＜0.001）。

圖3 不同質(zhì)量濃度的β-欖香烯對SH-SY5Y細(xì)胞活性(A) 及cAMP含量(B) 的影響(, n = 3)

圖4 β-欖香烯對嗎啡耐受細(xì)胞模型cAMP含量(A) 和TNF-α、IL-1β、IL-6、NR2B、cAMP和MOPR的mRNA (B、C) 和蛋白表達(D、E) 的影響(, n = 3)

4 討論

骨癌痛是由于骨癌患者晚期瘤體明顯腫大、組織壞死、侵蝕等造成富含神經(jīng)的被膜、血管、神經(jīng)纖維等嚴(yán)重受壓、損害與刺激，而出現(xiàn)難以忍受、劇烈的刺激性疼痛，是晚期骨癌的主要癥狀之一[11-12]。嗎啡廣泛用于疼痛治療，尤其是晚期骨癌痛患者，但長期應(yīng)用會產(chǎn)生嗎啡耐受，影響其鎮(zhèn)痛效果，其機制可能與MOPR脫敏和內(nèi)化有關(guān)，故對嗎啡耐受的改善是目前癌痛治療的重點[13]。β-欖香烯是從姜科植物溫郁金揮發(fā)油中分離出來的油狀單體，可通過對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)的調(diào)控發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。近年來β-欖香烯的止痛功效引起研究者的廣泛關(guān)注，但β-欖香烯在骨癌痛患者嗎啡耐受改善方面的效果仍有待進一步研究[15]。因此，本研究構(gòu)建大鼠骨癌痛-慢性嗎啡耐受模型，予以β-欖香烯或艾芬地爾處理，結(jié)果顯示，隨嗎啡給藥時間的增加，可使大鼠機械撤退閾值、熱退潛伏期逐漸下降，艾芬地爾、β-欖香烯可有效抑制大鼠機械撤退閾值、熱退潛伏期的下降，且β-欖香烯的作用呈劑量相關(guān)性，說明β-欖香烯具有一定的鎮(zhèn)痛作用，可有效緩解骨癌痛大鼠嗎啡耐受。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)疼痛相關(guān)基因的表達水平是嗎啡等阿片類藥物發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的重要機制[16]。MOPR是阿片類藥物發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的最主要亞基，阿片類藥物與MOPR結(jié)合時，可有效發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[17]。當(dāng)MOPR與阿片類激動劑結(jié)合時，胞內(nèi)cAMP等信號濃度降低，Ca2+內(nèi)流下降，K+外流增加，導(dǎo)致突觸前膜P物質(zhì)的釋放減少，阻止痛覺沖動的傳導(dǎo)，進而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[18]。NMDA受體由亞基NR1、NR2、NR3組成，其中NR2B是參與疼痛產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)亞基[19]。但在阿片類藥物的長期作用下，MOPR由G蛋白偶聯(lián)受體激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRKs）催化發(fā)生磷酸化機解偶聯(lián)，可激活下游磷脂酶C、腺苷酸環(huán)化酶通路，從而導(dǎo)致cAMP、甘油二酯、三磷酸肌醇在胞內(nèi)的表達水平逐漸上升，引起Ca2+內(nèi)流增加，激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）；PKC激活后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，同時使NR2B激活，進一步活化PKC，調(diào)節(jié)神經(jīng)元敏感狀態(tài)[20]。為進一步研究β-欖香烯緩解嗎啡耐受的具體作用機制，本研究構(gòu)建了大鼠骨癌痛-慢性嗎啡耐受模型及嗎啡耐受細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受可促進NR2B、cAMP表達，抑制MOPR表達，給予艾芬地爾或β-欖香烯后，則呈現(xiàn)相反趨勢，且β-欖香烯的作用呈劑量相關(guān)性，說明β-欖香烯可通過促進MOPR的表達，抑制NR2B、cAMP的表達，緩解神經(jīng)元敏感狀態(tài)，阻止痛覺沖動的傳導(dǎo)，進而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，改善嗎啡耐受。

在病理性疼痛產(chǎn)生和維持的整個過程中，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞是一個相互作用的信息網(wǎng)絡(luò)[21]。有研究表明，骨癌痛等外周病理性疼痛刺激可使初級傳入神經(jīng)纖維中樞端及傳導(dǎo)疼痛的二級神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)激活膠質(zhì)細(xì)胞，活化的膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細(xì)胞因子，進一步促進初級傳入纖維中樞端和二級神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，產(chǎn)生和維持病理性疼痛狀態(tài)，并使疼痛擴大化[22]。另有研究表明，炎癥反應(yīng)在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中也發(fā)揮重要作用，在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型中，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平明顯升高，阻斷炎性因子產(chǎn)生能夠有效緩解嗎啡耐藥性[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗎啡耐受可促進、和mRNA表達，給予艾芬地爾或β-欖香烯后，則呈現(xiàn)相反趨勢，且β-欖香烯的作用呈劑量相關(guān)性，說明β-欖香烯可通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，減少痛覺沖動的傳導(dǎo)，進而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，改善嗎啡耐受。

綜上所述，β-欖香烯具有一定的鎮(zhèn)痛作用，可通過調(diào)控MOPR/NR2B表達從而有效緩解骨癌痛大鼠嗎啡耐受。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of β-elemene on morphine tolerance in rats with bone cancer pain and its molecular mechanism

ZHOU Qin-fei, GONG Li-yan, BAO Guan-ai, DING Qun-fang, JI Jing-jing

Department of Rare Diseases and Head and Neck Medicine, Institute of Basic Medicine and Cancer of Chinese Academy of Sciences, The Cancer Hospital of University of Chinese Academy of Sciences, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China

To study the effect and mechanism of β-elemene on morphine tolerance in rats with bone cancer pain.Male Wistar rats were randomly divided into control group, morphine group, β-elemene low- and high-dose (0.7, 2.8 mg/kg) groups and ifenprodil (5 mg/kg) group, with 15 rats in each group.Control group was given normal saline tibia injection and ip dimethyl sulfoxide.After bone cancer pain-chronic morphine tolerance model was established in other groups, rats were ip corresponding drugs respectively, mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency were detected to evaluate pain behavior; qRT-PCR was used to detect tumor necrosis factor-α (), interleukin-1β (),, μ opioid receptor (),-methyl--aspartate receptor subunit 2B () and cyclic adenosine monophosphate () mRNA expressions in spinal cord tissues of rats in each group; Western blotting was used to detect the protein expressions of NR2B, cAMP and MOPR in spinal cord tissues of rats in each group.Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were treated with β-elemene (5, 10, 20, 25 μg/mL), activity of SH-SY5Y cells was detected by CCK-8 method, and kit was used to detect intracellular cAMP content of SH-SY5Y cells, to determine the appropriate concentration of β-elemene acting on SH-SY5Y cells; Control group, morphine group, β-elemene (5 μg/mL) group and ifenprodil (10 μmol/mL) group were set, control group was routinely cultured, and other groups were treated with 10 μmol/L morphine for 48 h to build a morphine-resistant cell model, and then β-elemene group and ifenprodil group were given with corresponding drugs, mRNA expressions of,,,,andwere detected by qRT-PCR, protein expressions of NR2B, cAMP and MOPR were detected by Western blotting.On 1st day of administration, compared with control group, mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency of rats in other groups were significantly increased (< 0.001).With the extension of administration time, mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency decreased gradually in morphine group.Mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency of rats in each administration group were significantly higher than those of morphine group (< 0.05, 0.01, 0.001).β-Elemene significantly inhibited the activity of SH-SY5Y cells (< 0.001) in a dose- and time-dependent manner; β-elemene had no significant effect on intracellular cAMP content of SH-SY5Y cells.Morphine tolerance promoted the expressions of TNF-α, IL-1β, IL-6, NR2B and cAMP in spinal cord tissue of rats and SH-SY5Y cells (< 0.001), and inhibited the expression of MOPR (< 0.001).The opposite trend (< 0.01, 0.001) was observed after the addition of ifenprodil or β-elemene, and the effect of β-elemene was dose-related.β-Elemene has a certain analgesic effect, and can effectively relieve morphine tolerance in rats with bone cancer pain by regulating MOPR/NR2B.

β-elemene; bone cancer pain; morphine tolerance; MOPR/NR2B; inflammatory factors

R285.5

A

0253 - 2670(2022)10 - 3070 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.017

2022-01-06

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2019ZB018）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY19H290001）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2018KY312，2020374375，2021433869）

周琴飛，碩士，主治醫(yī)師，研究方向為難治性癌痛。E-mail: zqfbb@126.com

通信作者：龔黎燕，碩士，主任醫(yī)師，研究方向為難治性癌痛。E-mail: gongliyanhz_hly@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]