毛羽佳 殷 俏 鄭琳璐 曾 軍

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病引起的常見的微血管并發(fā)癥，現(xiàn)為世界范圍內(nèi)致盲的主要原因之一[1]。其中血-視網(wǎng)膜屏障的破壞和視網(wǎng)膜新生血管的增生大大增加了視力喪失的風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。玻璃體內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素和抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)藥物是目前臨床上較為常用的治療方法，但效果仍差強(qiáng)人意，在相當(dāng)一部分患者中無(wú)效[5]。因此，積極尋求DR的新療法或新藥物對(duì)控制DR的進(jìn)展和降低失明率尤為重要。松果菊苷(ECH)是主要來源于肉蓯蓉中的一種具有抗炎、抗氧化和改善微循環(huán)等作用的苯乙醇苷類化合物。近來，有研究表明ECH可通過調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌層功能并改善肺動(dòng)脈重塑從而發(fā)揮對(duì)肺動(dòng)脈高壓引起的血管病變的保護(hù)作用[6]；在糖尿病小鼠模型中，使用ECH可改善小鼠肥胖、血脂異常及胰島素抵抗，并且能減輕小鼠糖尿病性肝損傷[7]、抑制糖尿病小鼠腎纖維化[8]、改善糖尿病小鼠心臟細(xì)胞脂質(zhì)代謝并抑制心臟細(xì)胞凋亡[9]。此外，有報(bào)道顯示ECH對(duì)缺氧大鼠肺動(dòng)脈平滑肌具有抗增殖作用[10]。視網(wǎng)膜新生血管是增生型DR患者視力下降的常見原因，鑒于此，推測(cè)ECH對(duì)DR引起的視網(wǎng)膜新生血管形成可能具有一定的抑制作用，但相關(guān)研究未見報(bào)道。因此，本研究采用在體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)并給予高糖(HG)處理模擬糖尿病環(huán)境，同時(shí)給予ECH干預(yù)以觀察其對(duì)HRCECs的作用并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料HRCECs購(gòu)自上海子實(shí)生物科技有限公司；ECH(純度: 98%)購(gòu)自西安天寶生物科技有限公司；1640培養(yǎng)基和2.5 g·L-1胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；D-葡萄糖購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室和基底膜購(gòu)自美國(guó)BD公司；Ki67抗原(Ki67)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、VEGF和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；辣根過氧化酶(HRP)、Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗購(gòu)自萬(wàn)類生物(上海)科技有限公司；RIPA裂解液、ECL發(fā)光底物和Lowry蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將HRCECs置于1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和 100 mg·L-1鏈霉素)中，在 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，并將HRCECs分為5組：正常對(duì)照(Con)組、高糖(HG)組、HG+1 μmol·L-1ECH組、HG+5 μmol·L-1ECH組和HG+25 μmol·L-1ECH組。Con組細(xì)胞采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；HG組細(xì)胞采用含25 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)；HG+1 μmol·L-1ECH組、HG+5 μmol·L-1ECH組和HG+25 μmol·L-1ECH組細(xì)胞采用分別含1 μmol·L-1、5 μmol·L-1和25 μmol·L-1ECH的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)96孔板預(yù)涂50 μL基底膜，然后在37 ℃下放置30 min固化。將各組HRCECs(每孔50×103個(gè))接種在固化的基質(zhì)凝膠上，培養(yǎng)48 h。利用顯微鏡觀察并采集圖像。使用ImageJ軟件-“血管生成分析”工具計(jì)算各組細(xì)胞管腔結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度。

1.2.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性將各組HRCECs以每孔10×103個(gè)的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，向每孔中加入20 μL MTT(5 g·L-1)，在37 ℃下孵育4 h。然后添加150 μL二甲基亞砜，并使用Spectras Max Plus微孔板讀取器在570 nm處測(cè)量每孔的吸光度(D)。相對(duì)細(xì)胞活性=D觀察組/D對(duì)照組×100%。

1.2.4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞集落形成能力細(xì)胞以每皿100個(gè)細(xì)胞的密度接種在35 mm的培養(yǎng)皿中，按分組條件進(jìn)行培養(yǎng)2周，每5 d更換一次培養(yǎng)基。用40 g·L-1多聚甲醛固定15 min，用結(jié)晶紫染色10 min，對(duì)各組細(xì)胞集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞中ICAM-1表達(dá)將各組HRCECs以每孔10×103個(gè)的密度接種于玻片上，培養(yǎng)48 h后，用1 mL免疫染色固定液固定細(xì)胞15 min，體積分?jǐn)?shù)5% FBS封閉30 min，分別室溫孵育11000稀釋比例的Ki67或ICAM-1一級(jí)抗體2 h，PBS洗滌4次后，分別室溫避光孵育11000稀釋比例的Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG或Alexa Fluor 647標(biāo)記兔抗小鼠IgG抗體1 h，PBS洗滌4次后，用DAPI染色細(xì)胞核，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞遷移能力用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后，1200 r·min-1離心3 min收集各組細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，制成100×103mL-1單細(xì)胞懸液。將100 μL細(xì)胞懸液加入24孔transwell板的上室(8 μm孔徑聚乙烯膜)，下室加入含體積分?jǐn)?shù)20% FBS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用棉簽除去上室的聚乙烯膜上表層的細(xì)胞，用甲醇固定聚乙烯膜下表層的細(xì)胞30 min，用5 g·L-1結(jié)晶紫染色。倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)將各組細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解液中裂解，并在4 ℃下以15 000 r·min-1離心10 min收集蛋白。用Lowry蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定各樣本中蛋白濃度。將含等量蛋白(30 μg)的每個(gè)樣品中進(jìn)行120 g·L-1十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用50 g·L-1BSA封閉膜上蛋白，4 ℃下加HIF-1α(1500)、VEGF(11000)和GAPDH(110 000)一抗孵育過夜，洗滌后，室溫孵育HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG二抗(11000)2 h，再次洗滌后，用ECL發(fā)光底物使蛋白顯像。用ImageJ軟件計(jì)算各組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組定量資料的比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ECH抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs新生血管形成能力細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Con組、HG組、HG+1 μmol·L-1ECH組、HG+5 μmol·L-1ECH組和HG+25 μmol·L-1ECH組細(xì)胞相對(duì)管狀結(jié)構(gòu)總長(zhǎng)度分別為(98.46±6.73)%、(212.38±10.62)%、(185.43±7.82)%、(146.51±9.43)%和(129.64±5.72)%；與Con組比較，HG組管狀結(jié)構(gòu)增多且管總長(zhǎng)度明顯增加(P<0.001)；與HG組比較，ECH呈劑量依賴性抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs管腔形成，管總長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.05、P<0.01、P<0.001)(圖1)。

圖1 各組HRCECs管腔形成圖像(×100)

2.2 ECH抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs增殖MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)和Ki67免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con組比較，HG組HRCECs活性、集落數(shù)和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比例均明顯增加(均為P<0.001)；與HG組比較，ECH能顯著降低HRCECs活性、集落形成能力和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比例，并呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01、P<0.001)(圖2、圖3和表1)。

圖2 各組HRCECs代表性的細(xì)胞集落

圖3 各組HRCECs中Ki67免疫熒光染色圖像

表1 各組HRCECs活性、集落數(shù)和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比例

2.3 ECH抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs遷移Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Con組、HG組、HG+1 μmol·L-1ECH組、HG+5 μmol·L-1ECH組和HG+25 μmol·L-1ECH組細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為(101.54±28.31)%、(727.96±59.36)%、(546.78±33.54)%、(384.15±39.94)%和(215.53±19.65)%；與Con組比較，HG可促進(jìn)HRCECs的遷移(P<0.001)，而ECH可呈劑量依賴性抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs的遷移(均為P<0.05)(圖4)。

圖4 各組HRCECs的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

2.4 ECH可抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路ICAM-1免疫熒光染色結(jié)果(圖5)顯示，Con組細(xì)胞中ICAM-1的熒光強(qiáng)度較低；HG組細(xì)胞中ICAM-1的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；HG+1 μmol·L-1ECH組、HG+5 μmol·L-1ECH組和HG+25 μmol·L-1ECH組隨著ECH濃度的增加,細(xì)胞中ICAM-1熒光強(qiáng)度逐漸減弱。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組比較，HG組細(xì)胞中HIF-1α及VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯增加(均為P<0.001)；與HG組比較，ECH可呈劑量依賴性逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，使HIF-1α和VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05、P<0.01、P<0.001)(圖6和表2)。

圖5 各組HRCECs中ICAM-1免疫熒光染色結(jié)果

圖6 Western blot檢測(cè)各組HRCECs中HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)

表2 各組HRCECs中HIF-1α和VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

DR為視網(wǎng)膜細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在高糖環(huán)境中導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖、視網(wǎng)膜微血管新生、血管通透性增加和視網(wǎng)膜脫離等一系列眼底病理改變[11-12]。而目前對(duì)DR的防治效果尚差強(qiáng)人意，因此探索新的DR防治藥物尤為必要。據(jù)報(bào)道，ECH對(duì)糖尿病的多種并發(fā)癥具有保護(hù)作用，如能夠改善糖尿病小鼠胰島素抵抗[7]和糖耐量[13]。而ECH對(duì)DR的影響并不清楚。本研究結(jié)果表明，ECH以劑量依賴性的方式抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs的增殖、遷移和新生血管形成，提示ECH可能是潛在的抗DR藥物。

糖尿病引起的高糖環(huán)境可導(dǎo)致視網(wǎng)膜供血不足，使視網(wǎng)膜處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，視網(wǎng)膜中HIF-1α表達(dá)上調(diào)[14-15]。HIF-1α作為體內(nèi)重要的氧含量受體和調(diào)節(jié)蛋白，在調(diào)節(jié)新生血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)代謝和炎癥等過程中發(fā)揮著重要作用[16]。VEGF是新生血管形成中最重要的調(diào)節(jié)因子，也是HIF-1α重要的下游靶點(diǎn)，HG可通過上調(diào)HIF-1α/VEGF信號(hào)活性誘導(dǎo)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移并促進(jìn)新生血管的形成，而減弱HIF-1α/VEGF信號(hào)活性可抑制HG誘導(dǎo)的上述變化[17]。同時(shí)，在DR小鼠模型中，與野生型小鼠相比，HIF-1α敲除小鼠視網(wǎng)膜中VEGF表達(dá)降低，血管滲漏和新生血管形成也顯著減少[18]。本研究顯示，ECH可逆轉(zhuǎn)HG誘導(dǎo)的HRCECs中HIF-1α和VEGF蛋白的高表達(dá)。ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成員，是介導(dǎo)黏附反應(yīng)的一個(gè)重要黏附分子。ICAM-1在正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈低表達(dá)，而缺氧/HG條件能通過HIF-1α/VEGF信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和HRCECs中ICAM-1表達(dá)上調(diào)[19-20]。另外，ICAM-1可通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、新生血管形成以及招募炎癥細(xì)胞的能力[21-22]。本研究結(jié)果顯示，ECH處理可降低HG誘導(dǎo)的HRCECs中ICAM-1的表達(dá)。本研究結(jié)果提示，ECH可能通過下調(diào)HIF-1α/VEGF相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs的增殖、遷移和新生血管形成的作用。

綜上所述，ECH具有抑制HG誘導(dǎo)的HRCECs增殖、遷移及新生血管形成的作用，且這些作用可能與其下調(diào)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路相關(guān)。另外，本研究還提示，ECH有改善DR的潛在治療效果，為改善DR提供了新的潛在藥物。