于 超

(大連大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116622)

槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長及NO產(chǎn)生的影響

于 超

(大連大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116622)

采用MTT法檢測槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響,用 Griess法檢測槲皮素對正常血管內(nèi)皮細(xì)胞及 ATP(三磷酸腺苷)、NA(去甲腎上腺素)作用下的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明,槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長及 NO分泌沒有影響,但能拮抗 ATP和 NA對血管內(nèi)皮細(xì)胞 NO產(chǎn)生的促進(jìn)作用,這個作用可能與離子通道有關(guān)。

槲皮素;血管內(nèi)皮細(xì)胞;一氧化氮;

槲皮素廣泛存在于蔬菜、水果及植物藥中,如在槐米、洋蔥、蜂蜜、葡萄酒中含量豐富,且易于提取、分離和檢測。近年來,國內(nèi)外醫(yī)藥工作者對槲皮素的研究日益增多,發(fā)現(xiàn)其具有許多藥理活性,主要有抗氧化、抗炎、降血壓、抗血小板聚集、抗癌變、抗衰老、抗突變、抗動脈粥樣硬化等[1〗。

血管內(nèi)皮不僅是血管內(nèi)膜的重要屏障,而且具有分泌功能。正常的內(nèi)皮功能對于血管壁具有重要的保護(hù)作用,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化及許多疾病的始動環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后發(fā)生的功能改變則是導(dǎo)致心血管疾病(如高血壓、心衰、冠心病、術(shù)后再狹窄、原發(fā)性肺動脈高壓等)發(fā)生發(fā)展的重要因素 ,同時也參與腎病、糖尿病等一些難治性疾病的病理過程[2]。

NO具有松弛血管平滑肌、抗血小板聚集的作用,對于心肌也有一定的保護(hù)作用[3]。研究表明下列以血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙為共同特點(diǎn)疾病,如糖尿病、腦梗死、冠心病及高血壓等疾病患者,其血清 NO水平明顯降低。

為了了解槲皮素與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能之間的關(guān)系,本文研究了槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304生長及 NO產(chǎn)生的影響,為進(jìn)一步探討槲皮素的藥理作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

血管內(nèi)皮細(xì)胞 ECV304購自武漢大學(xué)中國典型生物保藏中心,槲皮素由大連醫(yī)科大學(xué)李衛(wèi)平老師提供,RPM I1640培養(yǎng)干粉購自Invetrogen公司,胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響

采用MTT法測定槲皮素對 ECV304細(xì)胞生長的影響,實(shí)驗(yàn)分空白對照組、DMSO對照組及不同槲皮素劑量組。

2.2 槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響

采用 Griess法[4]測定槲皮素對 ECV304細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響,分別測定了槲皮素對正常ECV304細(xì)胞分泌 NO的影響以及槲皮素對ATP和 NE誘導(dǎo)的 ECV304細(xì)胞分泌 NO的影響。每個實(shí)驗(yàn)均設(shè)空白對照組和溶劑DMSO對照組。

3 結(jié)果與討論

3.1 槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響

圖 1 槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響

根據(jù)上圖可以看出,首先在本實(shí)驗(yàn)體系中最大濃度的 DMSO對 ECV304細(xì)胞的生長也沒有產(chǎn)生影響。槲皮素在 5umol/L到 40umol/L的濃度范圍內(nèi)對 ECV304細(xì)胞的生長有一定的抑制作用,且呈劑量依賴性,但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均沒有顯著差異。因此槲皮素在 5umol/L到40umol/L的濃度范圍內(nèi)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長并無明顯影響。

3.2 槲皮素對正常血管內(nèi)皮細(xì)胞 NO產(chǎn)生的影響

圖 2 槲皮素對正常血管內(nèi)皮細(xì)胞 NO產(chǎn)生的影響

由圖 2可以看出,首先 DMSO單獨(dú)作用血管內(nèi)皮細(xì)胞其并不能影響血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO。槲皮素在 5unol/Ll到 20 umol/L的濃度范圍內(nèi)對 ECV304細(xì)胞分泌NO也無影響,但當(dāng)槲皮素的濃度為 40 umol/L時可大量促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中 NO的產(chǎn)生,這可能是因?yàn)?40umol/L槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生了一定的損傷,雖然在生長上還沒有表現(xiàn)出來,但是已經(jīng)使其 NO產(chǎn)生明顯增加。因此,實(shí)驗(yàn)中槲皮素濃度最好控制在 20 umol/L濃度之內(nèi)。

3.3 槲皮素對 ATP作用下的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響

圖 3 槲皮素對ATP作用下的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響

由圖 3可以看出ATP對血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用。NO是由一氧化氮合成酶 (NOS)催化L精氨酸,在還原型輔酶、核黃素核苷酸、黃素腺苷酸等輔助因子作用下,經(jīng)過復(fù)雜反應(yīng)合成的。對于內(nèi)皮細(xì)胞而言,其合成的NO主要是由 eNOS催化而來,其催化過程依賴于細(xì)胞內(nèi)的Ca2+和鈣調(diào)蛋白,鈣離子內(nèi)流是必須條件。內(nèi)皮細(xì)胞 eNOS存在于細(xì)胞膜上的信號傳導(dǎo)區(qū)域內(nèi),稱為小窩 (Caveolae)。在靜息狀態(tài)下,eNOS黏附在小窩上,并與小窩蛋白(caveolin)結(jié)合處于失活狀態(tài);但在細(xì)胞受到刺激時,Ca2+i升高,eNOS迅速被降解,并發(fā)生磷酸化,從小窩上解離并被激活,NO合成增加[5]。研究表明ATP作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞以及血流對血管內(nèi)皮產(chǎn)生的切應(yīng)力,這些因素都可引起細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度升高,增加 NOS的活性,從而增加 NO的生成和釋放[3]。而不同濃度槲皮素均能抑制ATP對血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的促進(jìn)作用,而且其抑制作用隨著濃度的增加而增大,具有明顯的劑量依賴性。3.4槲皮素對 NE作用下的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響

圖 4 槲皮素對 NE作用下的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響

由圖 4可以看出 NE能夠顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生 NO。NE具有收縮血管的作用,而NO具有舒張血管的作用,但 NE還是能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞中 NO含量的增加,說明此處 NO是用來減弱縮血管物質(zhì)對血管平滑肌的直接的收縮效應(yīng)。而不同濃度槲皮素都能抑制 NE對血管內(nèi)皮細(xì)胞 NO產(chǎn)生的促進(jìn)作用,其抑制作用也隨著濃度的增加而增大,具有明顯的劑量依賴關(guān)系。NE促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生 NO趨勢和 ATP的相同,文獻(xiàn)亦表明 ATP和 NE對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用方式相同,都是通過離子通道作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此推測槲皮素是否和 ATP、NE作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的方式一樣,也是通過離子通道作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞?其確切的證據(jù)還有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

綜合以上結(jié)果表明,槲皮素在 5umol/L-20 umol/L濃度范圍內(nèi)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長沒有明顯影響;對血管內(nèi)皮細(xì)胞中 NO產(chǎn)生也沒有明顯的影響作用;槲皮素能夠拮抗 ATP和NE對血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的促進(jìn)作用,并且其拮抗作用隨著濃度的增加而增大。

[1]For mica Jv,RecdsonW.Review of the biologyof quercetin and relatedblotlavonoids[J].Fd Chem TOXIC,1995,33:1061-1080

[2]王慶綸,廖志輝.槲皮素的研究近況[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1998,10:90-91.

[3]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis-anupolate[J].N Eng J M ed,1986,314:488-494

[4]Young HK KL,Jun HL,Shin K,Tae JL,EunMJ,et al.8-Hydroxyquinoline inhibits iNOS expression and nitric oxide production by down-regulating LPS-induced activity of NF-jB and C/EBPb in Raw 264.7 cells.Biochemical and Biophysical Research Communications 2005,329(2):591-597.

[5]Perez Vizcaino F,Ibarra M,Cogolludo AL,et a1.Endothelium independent vasodilator effects of the flavonoid quercetin and its methylated membolites in rat conductance and resistance arteries[J].Phanm col Exp Ther,2002,302:66-72

Effect of Quercetin on the Growth and NO Generation of Vascular Endothelial Cells

YU Chao
(College ofBioengineering,Dalian University,Dalian,116622,China)

MTTmethod was used to detect the influence of quercetin on the growth of ECV304l cells and Griessmethod was utilized to detect the effect of quercetin on NO generation of normal and ATP or NA-induced ECV304 cells.Quercetin had no significant influence on the growth and NO generation of ECV304 cells,but could counteract the enhabcement activity ofATP and NE on the NO generation of vascular endothelial cells.

Quercetin;Vascular Endothelial Cells;NO

Q501 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:

1008-2395(2010)06-0084-03

2010-03-05