李鵬飛 羅家偉 康麗華 張國偉 茅馨木 吳安然 張文怡 管懷進

迄今為止，年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)的發(fā)病機制仍未完全清楚。研究證實，紫外線(UVB)輻射所造成的氧化損傷與ARC的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[1]。這種氧化損傷首先累及晶狀體上皮細胞(LEC)，造成細胞內(nèi)DNA和細胞膜質(zhì)子泵受損，從而激活細胞凋亡途徑。由于晶狀體本身存在一定的損傷修復(fù)機制，只有細胞內(nèi)損傷性DNA累積到一定程度時，才會引起LEC凋亡[2]。因此，DNA的損傷修復(fù)能力對LEC的存活至關(guān)重要。我們前期研究已證實，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)基因能通過堿基切除修復(fù)(BER)通路特異性去除DNA雙鏈中的8-氧鳥嘌呤(8-oxoG)，參與受損DNA的修復(fù)過程[3]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，OGG1基因的突變與老化和各種退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，也可能參與ARC的發(fā)生發(fā)展過程[4-6]。本研究以人LEC(SRA01/04細胞株)為研究對象，采用UVB照射細胞模擬氧化損傷環(huán)境，探討OGG1對UVB誘導(dǎo)損傷的LEC的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料SRA01/04細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。細胞培養(yǎng)實驗用品包括：DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶和細胞培養(yǎng)板(均購自美國Gibco公司)。手持UVB檢測燈購自上海光豪分析儀器公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，引物購自中國生工生物工程股份有限公司；靶向OGG1設(shè)計的siRNAs購自中國銳博生物科技有限公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗均購自中國ABclonal公司，BAX、BCL-2和15A3抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和UVB處理將凍存的SRA01/04細胞復(fù)蘇后，加入完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青鏈霉素的DMEM)進行常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞融合度達80%時，用Hanks液清洗細胞2次，加入適量的無菌PBS，置于紫外燈下30 cm處進行照射。將細胞分為UVB組和對照組，UVB照射時間分別為0 min(對照組)、10 min、15 min、30 min、45 min。照射后，加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量-PCR檢測根據(jù)Trizol試劑盒說明書的操作步驟提取本實驗的總RNA。按照說明書設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)時間。以GAPDH為內(nèi)參，比較各組細胞目的基因和相應(yīng)內(nèi)參的Ct值，采用2-△△Ct分析目的基因表達情況，實驗均重復(fù)3次。OGG1引物序列：上游為5’-TCCCGGTCTTCCTGATTAGC-3’，下游為5’-TACAAGAACTGGAGCACCGT-3’；GAPDH引物序列：上游為5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’，下游為5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染及分組利用siRNA敲降技術(shù)針對靶基因OGG1設(shè)計3個siRNA(分別為siOGG1#1、siOGG1#2和siOGG1#3)。同時，為了驗證出敲降效率最高的siOGG1，依據(jù)轉(zhuǎn)染情況將細胞分為siOGG1#1組、siOGG1#2組、siOGG1#3組、siNC組和空白對照組(不轉(zhuǎn)染)，實時熒光定量-PCR檢測各組細胞中OGG1 mRNA的相對表達量。后續(xù)為了驗證OGG1的表達下降對氧化損傷環(huán)境下細胞的作用，將細胞分為空白對照組、UVB組、UVB+siNC組和UVB+siOGG1#2組，觀察各組細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。具體實驗方法如下：首先，將細胞均勻接種至6孔板內(nèi)，待細胞密度合適后，每孔中加入Lipofectamine 3000和siRNA充分混勻，室溫孵育15 min。之后，放入培養(yǎng)箱中孵育細胞6 h后，將細胞培養(yǎng)基更換為含有血清的全培養(yǎng)基，并置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用UVB照射細胞，照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取蛋白，免疫印跡實驗檢測各組細胞中OGG1蛋白表情況。

1.5 免疫熒光法檢測細胞DNA氧化損傷轉(zhuǎn)染siOGG1#2后經(jīng)UVB照射，觀察細胞內(nèi)DNA氧化損傷程度的變化情況，檢測方法參考前期研究[7]。將細胞接種至細胞培養(yǎng)板，根據(jù)實驗設(shè)計分為UVB+ siNC組和UVB+siOGG1#2組，之后對細胞進行siRNAs靶向干預(yù)和UVB處理。孵育24 h后，用PBS清洗細胞。隨后加入40 g·L-1多聚甲醛，室溫固定30 min。配制30 g·L-1牛血清白蛋白+體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100溶液，室溫封閉2 h。之后，根據(jù)抗體15A3(染色反應(yīng)底物是8-oxoG，它是OGG1的修復(fù)作用靶點)說明書的比例用10 g·L-1牛血清白蛋白配制一抗反應(yīng)液，置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。次日，洗滌后避光，加入配置好的熒光二抗，室溫下孵育2 h。加Hoechst(110 000)避光孵育8 min染細胞核。最后，采用熒光顯微鏡避光拍攝。

1.6 CCK8實驗檢測細胞活力將細胞接種于96孔板，每孔10×103個細胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；根據(jù)實驗需要將細胞分為空白對照組、UVB組、UVB+siNC組以及UVB+siOGG1#2組，每組設(shè)置6個平行孔，棄培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8溶液；繼續(xù)置于培養(yǎng)箱孵育1～2 h(操作過程注意避光)；使用酶標(biāo)儀測定樣品在波長450 nm處的吸光度。

1.7 免疫印跡實驗檢測蛋白表達從培養(yǎng)箱中取出已處理過的細胞，加入蛋白裂解液(CM/RIPA，1/100)，冰上裂解，提取上清；BCA法進行蛋白定量后，進行凝膠電泳(80 V轉(zhuǎn)120 V)分離蛋白；采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(250 mA，2 h)將靶蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；采用5 g·L-1脫脂牛奶，在室溫下封閉2 h；參照目的抗體說明書將稀釋好的目的一抗加入PVDF膜中，置于4 ℃冰箱進行孵育過夜。次日，用TBST漂洗，之后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(二抗)進行室溫孵育2 h。洗膜后加入顯影劑，置于暗室內(nèi)曝光顯影。以GAPDH或α-tubline為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 UVB組和對照組細胞中OGG1的表達變化

2.1.1 UVB組和對照組細胞中OGG1 mRNA表達變化實時熒光定量-PCR檢測結(jié)果顯示：與對照組(UVB照射時間為0 min)相比，隨著UVB照射時間的延長，細胞中OGG1 mRNA相對表達量先上升后下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)；UVB照射時間為10 min時，OGG1 mRNA的相對表達量最高(圖1)。

圖1 UVB組和對照組細胞中OGG1 mRNA相對表達量 與對照組相比，***P<0.001。

2.1.2 UVB組和對照組細胞中OGG1蛋白表達變化免疫印跡實驗檢測結(jié)果顯示：UVB照射10 min時，OGG1蛋白相對表達量明顯較其他照射時間組升高，且與對照組(UVB照射時間為0 min)相比升高顯著(均為P<0.001)；隨著UVB照射時間的延長，細胞內(nèi)OGG1蛋白相對表達量呈時間依賴性下降(圖2)。因此，本實驗細胞氧化損傷模型采用UVB照射 10 min處理細胞。

圖2 UVB組和對照組細胞中OGG1 蛋白相對表達量 與對照組相比，***P<0.001,ns示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 OGG1敲降模型驗證實時熒光定量-PCR檢測結(jié)果顯示：與siNC組相比，靶向設(shè)計的轉(zhuǎn)染siOGG1組的三個亞組中細胞OGG1 mRNA相對表達量均顯著降低(均為P<0.001)，siOGG1#2組降低最為明顯(圖3)。此外，免疫印跡實驗檢測結(jié)果也證實：與siNC組相比，轉(zhuǎn)染siOGG1#2后，OGG1蛋白水平的表達也顯著降低。因此，選取siOGG1#2進行后續(xù)實驗的OGG1敲降模型的制作。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組細胞OGG1 mRNA相對表達量 與空白對照組相比，ns示差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與siNC組相比，***P<0.001。

2.3 轉(zhuǎn)染后經(jīng)UVB照射各組細胞的狀態(tài)變化

2.3.1 轉(zhuǎn)染后經(jīng)UVB照射各組細胞DNA氧化損傷程度變化免疫熒光染色結(jié)果顯示：與UVB+ siNC組相比，UVB+ siOGG1#2組15A3(染色反應(yīng)底物是8-oxoG，它是OGG1的修復(fù)作用靶點)染色陽性細胞明顯增多(圖4)。

圖4 免疫熒光染色結(jié)果顯示經(jīng)UVB照射后UVB+ siNC組和UVB+ siOGG1#2組15A3染色陽性細胞變化

2.3.2 轉(zhuǎn)染后經(jīng)UVB照射各組細胞活力變化CCK8實驗結(jié)果顯示：與UVB+siNC組和空白對照組相比，UVB+siOGG1#2組細胞活力均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)(圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)染后經(jīng)UVB照射各組細胞活力變化 ns示差異無統(tǒng)計學(xué)意義,**P<0.01，***P<0.001。

2.3.3 轉(zhuǎn)染后經(jīng)UVB照射各組細胞凋亡相關(guān)蛋白BAX和BCL-2表達情況免疫印跡實驗檢測結(jié)果顯示：與UVB+siNC組相比，轉(zhuǎn)染后UVB+siOGG1#2組細胞促進凋亡的蛋白BAX表達明顯增加，而抑制凋亡的蛋白BCL-2表達則明顯下降(均為P<0.001)(圖6)。

圖6 轉(zhuǎn)染后經(jīng)UVB照射各組細胞凋亡相關(guān)蛋白BAX和BCL-2表達情況 ns示與 UVB組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義; 與空白對照組相比,**P<0.01，***P<0.001; 與UVB+ siNC組相比,###P<0.001。

3 討論

ARC是白內(nèi)障的主要類型之一，其病因目前仍不明確[8]?，F(xiàn)階段通過手術(shù)摘出混濁的晶狀體仍是治療ARC的主要方法。因此，探明ARC的病因及發(fā)病機制對其防治具有重要意義[8]。分子生物學(xué)研究表明，自由基和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的LEC內(nèi)大分子物質(zhì)(如DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等)異常和細胞凋亡是ARC發(fā)病的病理基礎(chǔ)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，引起晶狀體氧化損傷與應(yīng)激的自由基來源有兩類，一類是由外源性UVB等對晶狀體組織長期刺激損傷所產(chǎn)生[10]；另一類則是由內(nèi)源性的線粒體氧化呼吸鏈損傷所致[11]。本研究利用UVB處理人LEC，模擬ARC發(fā)生的氧化微環(huán)境，建立體外人LEC 氧化損傷的細胞模型，旨在尋找能有效抑制UVB所引起的細胞內(nèi)DNA損傷的藥物，減少LEC的凋亡。

LEC內(nèi)DNA發(fā)生氧化損傷后，機體會自發(fā)啟動DNA氧化損傷修復(fù)系統(tǒng)進行防御。研究發(fā)現(xiàn)，DNA氧化損傷修復(fù)主要有5種通路，包括BER、直接修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、錯配修復(fù)和雙鏈斷裂修復(fù)通路[12]。上述任何一個DNA修復(fù)過程受到抑制均有可能導(dǎo)致細胞活力下降和凋亡發(fā)生。其中，BER通路是主要的DNA損傷修復(fù)通路[12-13]，該通路利用DNA糖苷酶識別并切除受損的核酸位點，并在DNA雙鏈上形成去嘧啶位點(AP位點)；然后AP核酸內(nèi)切酶在AP位點的5’端或者3’端切斷DNA鏈產(chǎn)生裂口；最終通過DNA聚合酶和DNA連接酶合成新的片段并填補缺口，形成DNA新鏈[13-14]。此通路能否有效完成，主要取決于氧化損傷修復(fù)基因能否及時有效地修復(fù)受到破壞的DNA。而OGG1是BER通路中發(fā)揮修復(fù)功能的關(guān)鍵酶，其修復(fù)機制主要是靶向識別和切除受損DNA雙鏈中氧化損傷的產(chǎn)物8-oxoG，從而修復(fù)其損傷，起到保護細胞的作用[15]。多項研究均已證實，OGG1基因的多態(tài)性與ARC易感性相關(guān)，有助于鑒定出ARC的高風(fēng)險人群[16-17]。我們前期研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，在三種輕度早期ARC患者樣本中，OGG1基因和蛋白表達均顯著升高，并且與8-oxoG的表達呈正相關(guān)。此外，OGG1基因的表達受其CpG島和組蛋白區(qū)表觀遺傳修飾的動態(tài)調(diào)節(jié)。本研究中，我們首先以時間梯度采用UVB照射來誘導(dǎo)人LEC以構(gòu)建細胞氧化損傷模型，模擬ARC中的氧化環(huán)境。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UVB照射10 min時，細胞中OGG1 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高。敲降OGG1表達之后，LEC內(nèi)DNA氧化損傷標(biāo)志物8-oxoG顯著增加，說明OGG1參與LEC內(nèi)受損DNA的修復(fù)過程。

研究發(fā)現(xiàn)，OGG1基因的失活或缺失能夠抑制癌細胞的增殖，從而引起癌細胞凋亡，如乳腺癌、前列腺癌、肺磷癌等[20-21]。也有研究表明，OGG1可能是阿爾茨海默病和ARC等多種衰老性和退行性疾病潛在的生物標(biāo)志物[4,22-24]。近年來，許多研究探討了OGG1在ARC患者中的表達和功能機制。在敲除OGG1基因的斑馬魚氧化損傷模型中，研究表明，OGG1功能的喪失會加速ARC的發(fā)展進程[25]。同時，OGG1在過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷模型中，對細胞的凋亡起調(diào)控作用，而針對UVB誘導(dǎo)的氧化損傷模型目前尚未見相關(guān)報道。本研究在UVB誘導(dǎo)的細胞氧化損傷模型中初步探討OGG1功能機制，設(shè)計靶向OGG1的siRNA，發(fā)現(xiàn)OGG1修復(fù)能力的減弱會明顯抑制LEC的細胞活力，從而導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果證實了OGG1基因在UVB誘導(dǎo)的細胞氧化損傷模型中通過BER通路參與受損DNA的修復(fù)過程，調(diào)控LEC內(nèi)受損DNA的修復(fù)和細胞凋亡過程。