張新霞 王小敏 陸麗紅 王保君 狄文玉

薯蕷皂素(Dio)是一種高生物活性的天然甾體皂甙元，已被證明具有抗高血脂、抗炎及抗癌的特性[5-7]，且其在糖尿病及并發(fā)癥(包括糖尿病腎病、糖尿病肝病、糖尿病生殖功能障礙等)中的治療作用亦有相關(guān)報道[8-13]。而Dio對DR疾病的效用以及內(nèi)在分子調(diào)控機制尚未完全清楚。因此，本研究通過HG誘導法構(gòu)建RPE細胞株(ARPE-19)損傷模型，觀察Dio對HG誘導的細胞損傷的影響并探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器ARPE-19細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)、改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司。細胞計數(shù)試劑8(CCK-8)試劑盒購自德國Roche公司。FITC標記膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀購自美國BD公司。丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。電化學發(fā)光(ECL)試劑、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海碧云天公司。RIPA試劑、β-actin抗體、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自武漢博士德公司。B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、cleaved Caspase-3、Yes相關(guān)蛋白(YAP)抗體和辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。Alexa Fluor 647-羊抗兔IgG熒光二抗購自美國Santa Cruz公司。2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針、DAPI購自美國Sigma-Aldrich公司。IX83熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)在含有體積分數(shù)為10%FBS、體積分數(shù)為1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)ARPE-19細胞，并置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱進行孵育。培養(yǎng)基每周更新3次。

1.2.2 HG誘導的ARPE-19細胞模型構(gòu)建與分組處理為探討Dio對RPE細胞的保護作用機制，本研究首先構(gòu)建了HG誘導的RPE細胞損傷模型。葡萄糖的濃度篩選：ARPE-19細胞以5×107個·L-1接種于96孔板，分別用遞增濃度(5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1和50 mmol·L-1)葡萄糖處理48 h，用CCK-8試劑盒檢測各濃度葡萄糖處理的細胞活性，選擇最低細胞活性匹配的葡糖糖濃度。

Dio的無細胞毒性劑量范圍篩選：ARPE-19細胞以5×107個·L-1接種于96孔板，分別用遞增濃度(0 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、8.0 mmol·L-1和16.0 mmol·L-1)Dio處理48 h，用CCK-8試劑盒檢測各濃度葡萄糖處理的細胞活性，選擇無細胞毒性的Dio劑量范圍。

根據(jù)CCK-8法篩選葡糖糖濃度和Dio無細胞毒性劑量范圍后，將細胞分為對照組[僅給予正常濃度(5 mmol·L-1)葡萄糖處理ARPE-19細胞48 h]、模型組[僅給予50 mmol·L-1葡萄糖處理ARPE-19細胞48 h]和低、中、高劑量Dio處理組[分別用50 mmol·L-1葡萄糖聯(lián)合0.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1Dio處理ARPE-19細胞48 h]。

1.2.3 細胞活性檢測用CCK-8試劑盒檢測不同處理方式處理后ARPE-19細胞活性。待細胞按“1.2.2”方法分組處理后，將CCK-8溶液(每孔10 μL)添加入培養(yǎng)基中，并將細胞再次放置于培養(yǎng)箱中孵育1 h。使用酶標儀在450 nm處測量吸光度。細胞活性=各處理組吸光度/對照組吸光度×100%。

馬克思主義與功利主義（實用主義）的論爭也即“問題與主義”之爭，是在科學社會主義傳入中國之后，馬克思主義與反馬克思主義進行的第一次比較著名的論戰(zhàn)，對馬克思主義及其公平思想的傳播產(chǎn)生了較大影響。

1.2.4 細胞凋亡檢測用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測各組ARPE-19細胞凋亡情況。1000 r·min-1離心5 min收集各組ARPE-19細胞后，將細胞重懸于結(jié)合緩沖液，每組各取500 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI后室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀分析并檢測各組細胞凋亡情況，用FlowJo軟件分析細胞凋亡比例。

1.2.5 細胞活性氧水平檢測用DCFH-DA熒光探針檢測活性氧(ROS)水平。1500 r·min-1離心5 min收集各組ARPE-19細胞后，加入10 μmol·L-1DCFH-DA試劑并在黑暗條件下于37 ℃孵育20 min。PBS洗滌3次后，用流式細胞儀在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和520 nm下檢測細胞，并用FlowJo軟件分析ROS陽性細胞比例。

1.2.6 氧化應(yīng)激指標檢測1000 r·min-1離心5 min收集各組ARPE-19細胞后，分別按照各檢測試劑盒說明，使用MDA、CAT和GSH-Px試劑盒檢測各組ARPE-19細胞的MDA水平以及CAT和GSH-Px活性情況。

1.2.7 線粒體膜電位檢測用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測各組ARPE-19細胞內(nèi)線粒體膜電位變化情況。ARPE-19細胞按照各組分組方法處理后，PBS洗3次；向細胞中加入2 mg·L-1的JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育30 min后，PBS洗3次；用熒光顯微鏡分別在488 nm激發(fā)波長和535 nm發(fā)射波長下檢測JC-1單體(綠色熒光)熒光強度值；在559 nm激發(fā)波長和590 nm發(fā)射波長下檢測JC-1聚集體(紅色熒光)熒光強度值。用紅綠熒光強度的相對比例來確定線粒體膜電位。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達水平用RIPA裂解液萃取各組ARPE-19細胞的蛋白，并各取20 μg蛋白進行Western blot檢測。封閉非特異位點后，在4 ℃下孵育一抗(Bcl-2、Bax、Caspase-3均按12000稀釋；cleaved Caspase-3、YAP均按11000稀釋，β-actin按18000稀釋)過夜。TBST洗滌后，室溫孵育HRP-羊抗兔IgG二抗1 h。加入ECL試劑后，用化學發(fā)光成像分析儀顯像，用Quantity One軟件定量蛋白的相對表達水平。

用免疫熒光染色法觀察YAP蛋白表達情況。將各組ARPE-19細胞固定并封閉后，在4 ℃下孵育YAP一抗(1500稀釋)過夜。用PBS漂洗后，室溫避光孵育Alexa Fluor 647-羊抗兔IgG二抗1.5 h。加入DAPI后，在熒光顯微鏡下觀察，用ImageJ軟件量化熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 HG誘導的ARPE-19細胞損傷模型建立CCK-8法檢測不同濃度葡萄糖處理ARPE-19細胞后的細胞活性，結(jié)果顯示(圖1A)，與5 mmol·L-1葡萄糖比較，葡萄糖濃度為30 mmol·L-1和50 mmol·L-1時ARPE-19細胞的細胞活性均明顯降低(P<0.05、P<0.001)，且在50 mmol·L-1時最為明顯，故后續(xù)實驗選擇葡萄糖濃度為50 mmol·L-1。

2.2 Dio對HG誘導的ARPE-19細胞損傷的影響CCK-8法篩選Dio無細胞毒性劑量范圍，結(jié)果顯示(圖1B)，與0 mmol·L-1Dio比較，Dio濃度為16.0 mmol·L-1時的ARPE-19細胞的細胞活性明顯降低(P<0.01)；而與0 mmol·L-1Dio比較，0.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、8.0 mmol·L-1Dio的細胞活性均無明顯改變(均為P>0.05)，故后續(xù)實驗選擇Dio濃度為0.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、8.0 mmol·L-1。與對照組比較，模型組細胞活性明顯降低(P<0.001)，細胞凋亡水平明顯增加(P<0.001)；與模型組比較，低、中、高劑量Dio處理組細胞活性均明顯增加，細胞凋亡水平均顯著降低，且呈濃度依賴性(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組細胞活性和細胞凋亡水平的比較 (n=3)

圖1 不同濃度葡糖糖(A)和Dio(B)對ARPE-19細胞活性的影響 與5 mmol·L-1葡糖糖比較，*P<0.05，***P<0.001；與0 mmol·L-1Dio比較，**P<0.01。

2.3 Dio對各組ARPE-19細胞的氧化應(yīng)激水平的影響與對照組比較，模型組細胞ROS和MDA水平均明顯升高(均為P<0.001)，細胞CAT和GSH-Px活性均明顯降低(均為P<0.001)；與模型組比較，低、中、高劑量Dio處理組細胞ROS和MDA水平均明顯降低，CAT和GSH-Px活性均明顯增加，且呈濃度依賴性(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組細胞ROS和MDA水平以及CAT和GSH-Px活性比較 (n=3)

2.4 Dio對各組ARPE-19細胞線粒體膜電位的影響JC-1檢測結(jié)果顯示，對照組、模型組以及低、中、高劑量Dio處理組細胞的線粒體膜電位分別為 0.67±0.04、0.05±0.01、0.09±0.01、0.16±0.02和 0.28±0.03；與對照組比較，模型組細胞的線粒體膜電位明顯降低(P<0.001)；與模型組比較，低、中、高劑量Dio處理組細胞的線粒體膜電位均明顯增加，且呈濃度依賴性(均為P<0.05)(圖2)。

圖2 各組細胞代表性JC-1免疫熒光染色圖

2.5 Dio對各組ARPE-19細胞中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3和YAP蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示(圖3、表3)，與對照組比較，模型組細胞中cleaved-Caspase-3蛋白和Bax蛋白表達水平均明顯升高(均為P<0.001)，細胞中Bcl-2蛋白和YAP蛋白表達水平均明顯降低(均為P<0.001)；與模型組比較，低、中、高劑量Dio處理組細胞中cleaved Caspase-3蛋白和Bax蛋白表達水平均明顯降低，細胞中Bcl-2和YAP蛋白表達水平均明顯升高，且呈濃度依賴性(均為P<0.05)。YAP蛋白免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖4，表3)，對照組細胞中YAP蛋白熒光強度較強；與對照組比較，模型組細胞中YAP蛋白熒光強度明顯降低(P<0.001)；與模型組比較，低、中、高劑量Dio處理組細胞中YAP蛋白隨著Dio濃度增加而逐漸增多，且YAP蛋白熒光強度呈濃度依賴性增強(均為P<0.05)。

圖3 Western blot檢測各組細胞中cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bax、Bcl-2和YAP蛋白表達情況

表3 各組細胞中cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、YAP蛋白表達水平及YAP蛋白熒光強度的比較 (n=3)

3 討論

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，影響了全世界超過4.25億人口，其中約有1/3的2型糖尿病患者合并有DR[1]。DR還是導致糖尿病患者失明的首要元兇[2]，而目前對于DR的防治效果并不令人滿意。因此，尋找安全有效的防治DR的藥物具有重要的臨床意義。在體動物模型中，Dio已被證明具有降糖和改善胰島素抵抗的藥理作用[8-13]。此外，眾所周知，DR不僅與葡萄糖代謝異常有關(guān)，還與炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)[4,14]。而目前已有研究報道，Dio具有良好的抗炎和抗氧化作用[5,7]。以上研究提示，Dio可能具有改善DR的作用，但目前相關(guān)報道尚少。因此，本研究探討了Dio是否具有治療DR的潛力，發(fā)現(xiàn)無細胞毒性劑量范圍內(nèi)的Dio能有效緩解HG誘導的RPE細胞活性減弱和凋亡增加，提示Dio是潛在的抗DR藥物。

DR患者處于長期高血糖狀態(tài)，RPE細胞則極易發(fā)生活化、抗氧化物酶損傷等病理性改變，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。另外，眾多研究[16-17]均已證明，在DR動物模型中給予抗氧化劑可減緩DR進展。本研究同樣檢測了Dio對HG誘導的RPE細胞氧化應(yīng)激的影響，結(jié)果顯示，Dio可逆轉(zhuǎn)HG誘導的RPE細胞ROS和MDA水平增加以及CAT和GSH-Px活性的降低，說明Dio可緩解HG誘導的細胞氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可激活凋亡基因Bax表達，破壞線粒體膜，進而激活線粒體凋亡途徑；另一方面，抑制氧化應(yīng)激可上調(diào)線粒體膜上抗凋亡蛋白Bcl-2，并進一步抑制Bax及Caspase蛋白激活，發(fā)揮保護線粒體和維持膜穩(wěn)定性作用[18-19]，故維持線粒體膜穩(wěn)定性在緩解細胞損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中，我們通過檢測線粒體膜電位及cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)Dio可抑制HG誘導的RPE細胞線粒體膜電位降低，并降低cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平和增加Bcl-2蛋白表達水平，說明Dio具有維持線粒體膜穩(wěn)定性和降低細胞凋亡的作用。

YAP分子是Hippo通路調(diào)控細胞存活和增殖的關(guān)鍵下游級聯(lián)效應(yīng)分子，可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[20-21]。近期有研究提示[22]，在糖尿病腎病細胞和動物模型中敲除Ras同源基因家族成員A(RhoA)可促使凋亡基因Bax升高、Bcl-2和YAP表達降低，而過表達YAP可抑制RhoA敲除誘導的足細胞凋亡。本研究通過檢測YAP蛋白表達和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，Dio可上調(diào)HG刺激的RPE細胞中YAP蛋白的表達，說明Dio對HG誘導的RPE細胞損傷的保護作用至少部分與上調(diào)YAP信號相關(guān)。

綜上所述，Dio對HG誘導的RPE細胞損傷具有細胞保護作用，且這一作用與激活YAP信號、降低氧化應(yīng)激、維持線粒體膜電位和抑制線粒體介導的細胞凋亡途徑有關(guān)。另外，本研究還提示Dio是潛在的抗DR藥物。