黃佳林 陳思琪 楊鈺華 李紹健 李藝*

隨著對疾病認知的加深和醫(yī)療技術的進步，膿毒癥患者的死亡率已經(jīng)顯著下降，但在痊愈出院的患者當中，仍有高達六分之一的患者遺留長期的損傷，其中包括認知功能障礙［1］。膿毒癥相關認知功能障礙的發(fā)病機制目前尚不明確，血管損傷和神經(jīng)炎癥可能是重要原因。其中，血管損傷被認為與膿毒癥休克密切相關［2］。循環(huán)障礙導致的組織低灌注是膿毒癥休克患者的癥狀之一［3］，而腦組織的慢性低灌注已被證實可導致動物的認知功能受損［4］。因此提高膿毒癥患者的腦組織灌注可能有利于改善其遺留的認知障礙。

葛根素是從傳統(tǒng)中藥葛根中提取的有效成分，臨床上可用于治療缺血性卒中［5］。研究證實葛根的黃酮類提取物可舒張小鼠腦膜中的血管并增加血流灌注［6］，但其有效成分和機制尚未完全明確。因此本實驗將在LPS 誘導的膿毒癥小鼠模型中驗證葛根素對認知功能和腦血流灌注的作用，并探討其可能的機制，以期為膿毒癥相關認知障礙的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物從中山大學實驗動物中心購買30 只8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，并飼養(yǎng)于SPF 級動物房。本研究的動物實驗方案經(jīng)過中山大學實驗動物倫理委員會審核批準（SYSU-IACUC-2021-B1718），在實驗過程中嚴格遵循動物倫理的相關規(guī)定對動物進行實驗操作。

1.2 主要試劑LPS、DMSO 購自美國sigma 公司，葛根素購自北京索萊寶公司。TLR4、MYD88、TRAF6 抗 體 由santacruz 公 司 提 供，Iba1 抗 體 購 自Wako 公司，GAPDH 購自Proteintech 公司。

1.3 研究方法將30 只小鼠隨機分為對照組（control 組）、造模組（LPS+Vehicle 組）、治療組（LPS+Puerarin 組），每組10 只。造模組和治療組腹腔單次注射LPS，注射劑量為5 mg/kg，對照組注射等體積生理鹽水。治療組在LPS 注射前兩小時、注射后第二和第三天分別通過腹腔注射100 mg/kg 葛根素，對照組和造模組注射等體積10%DMSO。小鼠于LPS 注射后72 小時進行行為學測試和腦血流灌注成像。小鼠完成檢測后進行取材，經(jīng)左心室灌注生理鹽水直至后分離大腦，一部分固定脫水并進行冰凍切片用于免疫熒光染色，另一部分提取蛋白質(zhì)進行Western Blot 分析TLR4、MYD88、TRAF6 的表達變化。

1.4 Y 迷宮測試在安靜舒適的環(huán)境中將小鼠輕柔地放入Y 形迷宮中，使用PhenoScan 軟件對小鼠的運動進行記錄分析，計算小鼠在各個臂中的交替次數(shù)并除以最大交替次數(shù)得到數(shù)據(jù)進行分析。

1.5 腦血流灌注成像使用氣體麻醉機將小鼠充分麻醉后剪開頭皮，將顱骨充分暴露，使用組織血流掃描成像分析系統(tǒng)（PERIMED PSI-ZR）對小鼠的腦血流進行1 分鐘的成像，對1 分鐘內(nèi)攝取的圖像中的血流數(shù)值取平均數(shù)進行分析。

1.6 統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)使用SPSS25.0 進行分析，定量資料以（±s）表示。采用LSD 法進行各組間的兩兩比較，P＜0.05 時認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 葛根素改善LPS誘導的小鼠認知功能受損 見圖1。

圖1 葛根素改善LPS 誘導的小鼠認知功能受損

2.2 葛根素改善LPS誘導的小鼠腦組織血流灌注下降 見圖2。

圖2 葛根素改善LPS 誘導的小鼠腦組織血流灌注下降

圖2 葛根素改善LPS 誘導的小鼠腦組織血流灌注下降

2.3 葛根素對膿毒癥模型小鼠腦組織TLR4信號通路的影響 見圖3。

圖3 葛根素對膿毒癥模型小鼠腦組織TLR4 信號通路的影響 注：對照組、造模組、治療組小鼠腦組織TLR4、MYD88、TRAF6 的表達情況（圖A、C、E）及與GAPDH 比值的統(tǒng)計（圖B、D、F）。與對照組相比，*P＜0.05；與造模組相比，#P＜0.05。

2.4 葛根素對LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化的影響 見圖4。

圖4 葛根素對LPS 誘導的小膠質(zhì)細胞活化的影響

3 討 論

LPS 誘導的膿毒癥是研究膿毒癥最常用的動物模型之一。Savi 等［7］對使用該模型的文獻進行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)不同劑量的LPS 均可導致動物急性期或慢性期的認知功能改變。膿毒癥休克是膿毒癥的表現(xiàn)之一，可表現(xiàn)為器官的血流灌注降低，嚴重時可導致死亡［3］。既往研究發(fā)現(xiàn)，在通過腹腔內(nèi)注射糞便造成膿毒癥模型的動物中可出現(xiàn)腦血流的顯著降低，并可能與動物的認知功能下降有關［8］。因此，改善LPS 導致的腦組織灌注下降可能有助于減輕LPS 導致的認知障礙。

TLR4 是LPS 的直接作用靶點，而葛根素已被證實可抑制TLR4 及下游通路的激活［9］。因此，本研究通過研究葛根素對LPS 誘導小鼠認知功能下降的作用，發(fā)現(xiàn)葛根素可通過抑制LPS 激活的TLR4/MYD88/TRAF6 通路改善小膠質(zhì)細胞的活化，提高小鼠腦組織的血流灌注進而改善小鼠的認知功能。本研究將為膿毒癥及膿毒癥休克患者認知功能受損的治療提供新思路。