黃泳清 陳穎 溫可馨 周淑嫻 耿登峰

急性心肌梗死（AMI）是危害人類生命的重要疾病之一，其發(fā)病年輕化趨勢日漸嚴(yán)重，對其早期診治的研究尤為重要。因此，近年來應(yīng)用生物信息學(xué)方法在Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫中下載基因芯片進(jìn)行分析以挖掘AMI 新的診斷和治療靶點(diǎn)的研究逐漸增多然而，針對發(fā)生在特定年齡的AMI 特殊機(jī)制的研究較少，60 歲以下患者發(fā)生AMI 的核心基因和調(diào)控因子尚無報(bào)道，因此，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法在GEO 中提取數(shù)據(jù)并分析60 歲以下AMI 潛在的治療及藥物靶點(diǎn)，為其早期診斷及治療提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載和初步分析在GEO 數(shù)據(jù)庫下載GSE34198 基因芯片，利用在線工具GEO2R 對差異表達(dá)基因進(jìn)行預(yù)處理，根據(jù)P＜0.05 和| logFC | ＞0篩選差異基因。

1.2 差異基因的GO 和KEGG 通路分析基因本體論（GO）是一種常見的功能富集分析，包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組成。KEGG 是一個(gè)被廣泛使用的數(shù)據(jù)庫，它存儲了大量關(guān)于基因組、生物途徑、疾病、化學(xué)物質(zhì)和藥物的通路數(shù)據(jù)。采用DAVID 進(jìn)行通路富集分析。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因鑒定STRING數(shù)據(jù)庫通過評估差異基因間的蛋白互作關(guān)系進(jìn)一步評估差異基因間的關(guān)系。提取出總分大于0.4的PPI 對。隨后使用Cytoscape 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。節(jié)點(diǎn)連通性越高對維護(hù)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性就越重要。在本研究中，連通性排名前10 位的基因被確定為核心基因。

1.4 檢索已知AMI 易感基因和保護(hù)基因孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）是一個(gè)不斷更新的人類孟德爾遺傳疾病數(shù)據(jù)庫，提供全面、權(quán)威的疾病相關(guān)遺傳變異信息概述。根據(jù)急性心肌梗死的關(guān)鍵詞，根據(jù)不同的發(fā)病機(jī)制搜索相關(guān)易感基因并進(jìn)行分類。

1.5 已知驅(qū)動(dòng)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析分析10 個(gè)已篩選出的核心基因和已知AMI 易感基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以確定在年齡小于60 歲的患者中更可靠的核心基因。

1.6 倫理審查該研究經(jīng)中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（SYSEC-KY-KS-2022-081），患者均由原始數(shù)據(jù)來源簽署知情同意書。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因的篩選人群資料見表1；篩選出1085 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因570 個(gè)，下調(diào)基因515 個(gè)。

表1 微陣列數(shù)據(jù)庫的基線特征的比較

注：與對照組比較，*P＜0.05，AMI，Acute myocardial infarction，急性心肌梗死。

2.2 差異基因的功能富集分析GO 功能富集分析結(jié)果和KEGG 通路分析結(jié)果如表2。

表2 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因鑒定結(jié)果如圖1。

圖1 根據(jù)差異基因的蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)之間的連接度，篩選出10 個(gè)核心基因，其中紅色標(biāo)記為上調(diào)基因，黃色標(biāo)記為下調(diào)基因。

2.4 核心基因與AMI 已知易感基因的相互作用在OMIM 數(shù)據(jù)庫中，共發(fā)現(xiàn)51 個(gè)已知AMI 驅(qū)動(dòng)基因和3 個(gè)保護(hù)基因。核心基因與易感基因的相互作用關(guān)系如圖2。

圖2 10 個(gè)核心基因與已知AMI 易感基因相關(guān)性的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（紅色是核心基因，綠色是易感基因）。

3 討 論

急性心肌梗死（AMI）是威脅人類生命的重大心血管急癥。由于有效治療時(shí)間較短和心肌的不可再生，AMI 預(yù)后較差。雖然已有挖掘AMI 診治相關(guān)的生物標(biāo)志物的研究，但對60 歲以下發(fā)生AMI 患者的核心基因和機(jī)制至今仍不清楚。

既往研究報(bào)導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促進(jìn)AMI的發(fā)生發(fā)展，AMI 引發(fā)的心肌纖維化與心肌細(xì)胞壞死、心肌間質(zhì)細(xì)胞增生、成纖維細(xì)胞異常增殖有關(guān)［1］，本研究結(jié)果提示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖是60歲以下AMI 患者重要的生物過程之一。

乙型肝炎是本研究中相關(guān)度最高的關(guān)鍵通路。既往研究表明，乙型肝炎病毒感染可產(chǎn)生高氧化應(yīng)激狀態(tài)，干擾素誘導(dǎo)蛋白-10 和血清可溶性尿激酶纖溶酶原激活物受體的上調(diào)可促進(jìn)血小板激活，增加動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成風(fēng)險(xiǎn)［2］。Yang Y 等的基因芯片分析顯示破骨細(xì)胞分化和B 細(xì)胞受體信號通路是AMI 的關(guān)鍵通路［3］。但在該研究中，這些通路被下調(diào)了，與我們的研究相悖。我們推測乙型肝炎和破骨細(xì)胞通路是年齡小于60 歲的AMI 發(fā)病的關(guān)鍵通路，但破骨細(xì)胞分化的作用仍待進(jìn)一步研究。

兩個(gè)PPI 分析提示MAPK1、CKAP4 和GRB2 是與AMI 已知易感基因相關(guān)的核心上調(diào)基因。編碼增殖蛋白激酶1（MAPK1），也稱為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié) 激 酶（ERK）2。 研 究 表 明，IL- 17A 通 過p38MAPK/ERK1/2 途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤并激活NLRP3，加重AMI 的炎癥反應(yīng)［4］。Lorenz 等的人體實(shí)驗(yàn)表明ERK1/ERK2 的特定磷酸化事件通過整合不同的上游信號誘導(dǎo)衰竭心臟的心肌肥大［5］。本研究結(jié)果也提示AMI 已知易感基因中與炎癥和免疫、脂代謝和凝血功能相關(guān)者都與MAPK1 有關(guān)。因此，我們推測MAPK1 可能通過影響炎癥、脂代謝和凝血功能參與低于60 歲AMI 的發(fā)生發(fā)展，并通過促進(jìn)心肌肥大影響其預(yù)后。

編碼細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4（CKAP4）是一種穩(wěn)定的跨膜蛋白。關(guān)于CKAP4 對心血管疾病作用的研究很少，但其在癌癥中的重要作用已得到證實(shí)。Kimura，H.等報(bào)道，來自DKK1/CKAP4 的信號通過PI3K/AKT 途徑促進(jìn)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖［6］本研究結(jié)果提示CKAP4 表達(dá)上調(diào)，并與已知的調(diào)節(jié)AMI 脂代謝的易感基因有關(guān)。因此，我們推測CKAP4 在細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂質(zhì)代謝方面的作用可能促進(jìn)60 歲以下AMI 的發(fā)生。

另一個(gè)與已知AMI 易感基因相關(guān)的核心上調(diào)基因是編碼生長因子受體結(jié)合蛋白-2（GRB2）。Zhang，S.等對Grb2+/-壓力過載模型小鼠的研究提示GRB2 與免疫調(diào)節(jié)、心肌細(xì)胞生長和心肌纖維化密切相關(guān)［7］。本研究表明GRB2 與AMI 免疫相關(guān)易感基因ESR1 有關(guān)。推測GRB2 可能通過免疫調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長和心肌纖維化影響AMI 的發(fā)生和預(yù)后。此外，有研究表明GRB2 通過穩(wěn)定免疫受體酪氨酸激活基序信號中的LAT 信號體在血小板止血和血栓形成中發(fā)揮重要作用［8］。GRB2 可能是抗血小板治療的靶基因。

綜上，乙型肝炎和破骨細(xì)胞分化是60 歲以下AMI 的主要上調(diào)通路，MAPK1 和CKAP4 可能通過炎癥反應(yīng)機(jī)制促進(jìn)AMI 的發(fā)生發(fā)展，可作為潛在的診斷標(biāo)志物。MAPK1 和CRB2 在促進(jìn)心肌肥大、心肌細(xì)胞生長、纖維化、免疫調(diào)節(jié)和抗血小板等方面可能是潛在的藥物靶點(diǎn)。