羅岳蓮 劉景 彭書崚

對實驗動物的生理參數(shù)，尤其是血壓進行監(jiān)測是開展動物實驗研究的基礎(chǔ)［1］。目前常用的實驗動物的血壓測量法可分為有創(chuàng)和無創(chuàng)兩類［2］。有創(chuàng)法，包括充液導(dǎo)管法和植入式遙測法，導(dǎo)管在動脈中直接感受血管壁的壓力，讀數(shù)最為準(zhǔn)確，其中遙測法被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”［3］，但遙測法因侵入性和價格昂貴，在實際中受限；股動脈插管法價格相對低廉，卻因創(chuàng)傷、出血等因素可能干擾血流動力學(xué)參數(shù)。此外，有創(chuàng)法不適用于大量動物血壓測量。無創(chuàng)法，主要是指尾套法，原理是通過血流阻斷再通時血管的振動間接獲得脈搏的脈動，對動物的消耗和刺激最小，適用于短期和長期研究中反復(fù)測量動物血壓［4］。但尾套法也具有無法連續(xù)監(jiān)測血壓及所測結(jié)果較遙測法偏高等不足。有研究提出應(yīng)用低濃度麻醉藥使動物處于淺麻醉狀態(tài)代替清醒束縛。低濃度異氟醚（1%）對動物心輸出量和血氣結(jié)果影響甚微，相較于異氟醚，七氟醚具有更優(yōu)的穩(wěn)定性及安全性，對血流動力學(xué)參數(shù)的影響更?。?］。本研究在2%低濃度七氟醚維持小鼠淺麻醉狀態(tài)下，采用尾套法測量血壓，構(gòu)建七氟醚-尾套法，將其分別與清醒束縛法及股動脈插管法比較，評價其測量小鼠血壓和心率的效率和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料（1）實驗動物：SPF 級雄性C57BL/6 小鼠（10-12 周齡，體重22-29 g）購自中山大學(xué)實驗動物中心。動物于室溫23℃、明暗各12 h 交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。實驗操作均符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，倫理審查批準(zhǔn)編號為：SYSUIACUC-2019-B836。

（2）主要儀器：多動物麻醉機（V703001，Harvard，USA）；麻醉氣體監(jiān)護儀（B450，GE，F(xiàn)inland）；體溫維持儀（ThermoStar，瑞沃德，中國）；多通道生理記錄儀（MP160，BIOPAC ，USA）；生理信號采集及處理軟件（AcqKnowledge 5，BIOPAC，USA）；智能無創(chuàng)血壓計（BP-2010A，Softron，北京軟?。?/p>

1.2 實驗方法（1）實驗分組。試驗1：將12 只小鼠隨機分2 組：CON 組（n=6），使用清醒束縛法測壓和SEV 組（n=6），使用七氟醚-尾套法測壓（試驗2：8 只小鼠同時使用七氟醚-尾套法和股動脈插管法測量血壓（Union 組，n=8）。（2）麻醉方案：將SEV 組和Union 組小鼠置于麻醉誘導(dǎo)箱中，以2 L/min 速率輸送5%七氟醚及100%O2誘導(dǎo)麻醉，用氣體監(jiān)護儀監(jiān)測麻醉濃度，待小鼠翻正反射消失、刺激腳趾無反應(yīng)時視為誘導(dǎo)完全，迅速從誘導(dǎo)箱中取出，置于加熱墊上并戴上氣麻面罩，使用2%七氟醚持續(xù)吸入維持淺麻醉，使用反饋式加熱墊維持肛溫37.0℃。（3）血壓測量：對CON 組小鼠使用智能無創(chuàng)血壓計進行尾動脈血壓測量。如前所述，正式實驗開始前連續(xù)5 天進行預(yù)測量［6］。第6天正式測壓，提前1h 將小鼠放入操作室中適應(yīng)環(huán)境，引導(dǎo)小鼠進入鼠網(wǎng)中，包裹鼠袋固定，置于37℃保溫筒中，ADDIN EN.CITE［6］。將加壓傳感器置于鼠尾根處，尾套充氣加壓至180 mmHg，放氣超過20 s，收集收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、平均動脈壓（MBP）和心率（HR），同時記錄小鼠從開始測量至達到穩(wěn)定結(jié)果的時間，穩(wěn)定結(jié)果定義為連續(xù)三組MBP 相差不超過15 mmHg［7］。取5 組穩(wěn)定數(shù)據(jù)計算平均值用于分析。SEV 組小鼠無預(yù)測量，第6 天麻醉后經(jīng)尾套測壓，操作同CON 組。對Union 組小鼠進行右側(cè)股動脈插管并使用多通道生理記錄儀測量有創(chuàng)血壓。股動脈插管流程如下：將PE-10 聚乙烯導(dǎo)管注滿20 U/ml 肝素鈉生理鹽水溶液備用。小鼠麻醉后，取仰臥位，在右側(cè)腹股溝區(qū)切開一10 mm 切口，在體式顯微鏡下分離股動脈，結(jié)扎遠心端，用血管夾阻斷近心端血流，持Vannas 剪小心剪開一“V”型破口，將導(dǎo)管緩慢插入股動脈內(nèi)，固定，移去動脈夾，縫合后皮下注射0.5%利多卡因溶液。術(shù)畢小鼠取俯臥位，將導(dǎo)管連接到BIOPAC 系統(tǒng)采集血壓信號，讀數(shù)穩(wěn)定5-10 min 后，以1 kHz 頻率采集1 min的血壓數(shù)據(jù)用于分析，同時經(jīng)尾套采集無創(chuàng)血壓數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析方法包括兩獨立樣本t檢驗、配對t檢驗及Bland-Altman 分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性，levene 檢驗方差齊性。連續(xù)性數(shù)值資料數(shù)據(jù)以（±s）形式進行統(tǒng)計描述。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖表用GraphPad Prism 8.0 繪制。

2 結(jié) 果

2.1 束縛與淺麻醉對兩組小鼠血流動力學(xué)的影響見表1，圖1。

圖1 CON 組和SEV 組測量達到穩(wěn)定所需時間 （A）和血壓Bland-Altman 分析圖（B-D）。A:清醒束縛法與七氟醚-尾套法測定血壓達到穩(wěn)定結(jié)果所需的時間。（****：P＜0.0001）。B-D 分別表明清醒束縛法與七氟醚-尾套法小鼠收縮壓、舒張壓和心率具有良好的一致性。

表1 CON 組和SEV 組小鼠的血壓和心率比較（n=6， ± s）

表1 CON 組和SEV 組小鼠的血壓和心率比較（n=6， ± s）

組別CON SEV P Weight（g）25.2±1.3 24.6±1.2 0.5623 SBP（mmHg）105±2 105±2 1.000 DBP（mmHg）57±10 60±12 0.631 MBP（mmHg）73±7 75±8 0.657 HR（bpm）583±20 618±56 0.180

2.2 七氟醚-尾套法與股動脈插管法血壓測量結(jié)果比較見圖2。

圖2 Union 組中同時使用七氟醚-尾套法與股動脈插管測量血壓結(jié)果。A.B.七氟醚-尾套法與股動脈插管法相比SBP、DBP、MBP 及HR 統(tǒng)計結(jié)果。（Tail-cuff：尾套組，F(xiàn)emoral：股動脈插管組。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001） C.D.七氟醚-尾套法與股動脈插管法SBP、DBP 的散點圖。兩種方法測量SBP 呈正相關(guān)性（r=0.8645，P=0.0056）（C），DBP 無明顯線性趨勢（D）。

3 討 論

無創(chuàng)尾套法是目前最常應(yīng)用于動物間接血壓測量的方法［8］。研究表明，多種測量相關(guān)因素會對血流動力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響，包括小鼠是否提前訓(xùn)練、測量者的性別。因此，為了獲得更準(zhǔn)確的數(shù)值，應(yīng)對潛在的偏倚進行控制。同時，提前進行預(yù)測量訓(xùn)練可以減少動物應(yīng)急反應(yīng)所致的血壓升高，然而預(yù)測量需花費5 d 時間［9］。最近有研究初步表明1%異氟醚應(yīng)用于尾套法測量時與清醒束縛法相比一致性較高［7］。本研究構(gòu)建了一種新的測量方法，使用較低濃度的七氟醚（2%）維持小鼠淺麻醉狀態(tài)，即七氟醚-尾套法，與傳統(tǒng)清醒束縛法相比，兩組小鼠的SBP、DBP、MBP 和HR 的數(shù)值相近（表1），Bland-Altman 分析顯示較好的一致性（圖1）。結(jié)果表明七氟醚-尾套法測量小鼠血流動力學(xué)參數(shù)較可靠，且七氟醚-尾套法可省略預(yù)測量步驟、節(jié)約達到穩(wěn)定結(jié)果的時間，效率更高。為驗證七氟醚-尾套法的準(zhǔn)確性，本研究將其與股動脈插管法同時測量同一小鼠的血壓，結(jié)果表明兩種方法的SBP 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A），數(shù)據(jù)具有強正相關(guān)性（圖2C），而股動脈插管法DBP 及MBP高于七氟醚-尾套法，原因可能是PE 導(dǎo)管材質(zhì)較硬，順應(yīng)性較小致DBP 測量結(jié)果升高［10］，而MAP也因計算而隨之升高（MBP=1/3SBP+2/3DBP）。

綜上所述，本研究構(gòu)建的七氟醚-尾套法用于測定成年雄性C57BL/6 小鼠的血壓，與清醒束縛法相比，血壓評價結(jié)果具有高效性與合理的一致性。與直接法相比，SBP 結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性。因此，在對實驗動物進行心血管系統(tǒng)研究或表型篩選時，七氟醚-尾套法可高效準(zhǔn)確地用于監(jiān)測血流動力學(xué)參數(shù)。