韋立志 劉國萍 白法承 唐微艷 楊斌

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率與高致死率的特點。據(jù)統(tǒng)計，我國每年因肝癌死亡患者數(shù)約占全球50%，排名全球首位［1］。廣西是全國肝癌高發(fā)地區(qū)之一，近年肝癌發(fā)病率仍呈逐年上升的趨勢，疾病防治形勢嚴峻。中藥具有安全性高、毒副作用小、患者接受度高等優(yōu)點，對緩解肝癌患者癥狀，提高生活質(zhì)量具有較好的幫助。

中藥木棉花，系木棉科木棉屬植物木棉的干燥花，廣西、廣東地區(qū)人民常用于治療腸炎、泄瀉、瘡毒等疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，木棉花富含黃酮、多糖、脂肪酸等多類活性成分，具有抗炎、抗腫瘤等藥理學(xué)作用［2，3］。在本研究中我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對木棉花和肝癌靶點進行匯集、通路富集分析，預(yù)測相關(guān)作用機制，并通過分子對接進行初步驗證。

1 實驗方法

1.1 木棉花有效成分篩選及靶點預(yù)測以“木棉花”為檢索詞，導(dǎo)入TCMSP 數(shù)據(jù)庫，篩選標準為口服生物利用度≥40%，類藥性≥0.2［4］，獲得木棉花有效活性成分。

將篩選獲得的木棉花有效活性成分分別導(dǎo)入藥物靶點數(shù)據(jù)庫Pharmmapper、Ctdbase、TargetNet，刪除重復(fù)靶點，獲得木棉花有效活性成分藥物靶點。

1.2 肝癌疾病靶點預(yù)測以“Liver cancer”、“Hepatic carcinoma”、“Hepatocellular carcinoma”為檢索詞，導(dǎo)入疾病靶點數(shù)據(jù)庫GeneCards、Disgenet Version，刪除重復(fù)靶點，獲得肝癌疾病靶點。

1.3木棉花防治肝癌潛在作用靶點預(yù)測將木棉花有效活性成分藥物靶點與肝癌疾病靶點進行交匯比對獲得共同作用靶點，繪制韋恩圖。

1.4 木棉花防治肝癌蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將共同作用靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，選擇“Multiple proteins”項，研究種屬限定為“Homo sapiens”，以相互作用得分＞0.4 為限定條件［4］，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）。緊接著將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，并通過Cytohubba 插件篩選評分靠前核心蛋白。

1.5 木棉花防治肝癌核心蛋白的數(shù)據(jù)庫驗證通過The Human Protein Atlas、TIMER 數(shù)據(jù)庫對核心蛋白在正常肝組織與肝癌組織中的蛋白與基因表達差異情況進行分析。

1.6 木棉花防治肝癌GO 富集和KEGG 通路分析將共同作用靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫中，進行GO 富集和KEGG 通路分析，以P≤0.05 為條件，進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 分子對接驗證選擇木棉花有效活性成分通過分子對接驗證其與預(yù)測排名靠前的信號通路核心靶點蛋白的親和力大小。對接成功后，以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為篩選依據(jù)，整理分析對接結(jié)果中的docking scores 分數(shù)并進行數(shù)據(jù)分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 活性成分篩選結(jié)果數(shù)據(jù)挖掘獲得木棉花有效活性成分5 個，分別為菠菜甾醇、豆甾醇、槲皮素、4-乙烯基氯芐以及橙皮素，見表1。

表1 木棉花活性成分

2.2 木棉花活性成分對肝癌潛在作用靶點數(shù)據(jù)挖掘共獲得木棉花活性成分作用靶點165 個，肝癌疾病靶點200 個。交匯比對后共得到33 個交集靶點。結(jié)果詳見圖1。

圖1 木棉花活性成分對肝癌潛在作用靶點（韋恩圖）

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖2 所示，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)為33，邊數(shù)為169，平均節(jié)點數(shù)10.2。Cytohubba 預(yù)測的前十核心靶點分別為：ESR1、TNF、EGFR、MDM2、RELA、PTPRC、JAK2、AR、MMP9 和MET。

圖2 木棉花活性成分對肝癌潛在作用靶點PPI 圖

2.4 GO 富集分析結(jié)果GO 富集分析結(jié)果包括生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）三項。如圖3 所示木棉花對肝癌的治療作用主要是通過參與了以下生物過程：調(diào)控細胞增殖、肽基絡(luò)氨酸磷酸化過程、DNA 轉(zhuǎn)錄、調(diào)控RNA 聚合酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。細胞組成項方面，預(yù)測結(jié)果主要富集于：質(zhì)膜、核漿、細胞核、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞質(zhì)等。分子功能預(yù)測結(jié)果主要包括：蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性、ATP 酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合等。

圖3 木棉花活性成分對肝癌潛在作用靶點GO 富集分析結(jié)果

2.5 KEGG 通路分析結(jié)果DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫預(yù)測排名前10 信號通路見圖4 所示，其中包括：癌癥通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K/Akt 信號通路、MicroRNAs 等。

圖4 木棉花活性成分對肝癌潛在作用靶點KEGG 富集分析結(jié)果

2.6 基因及蛋白表達差異驗證核心靶點在正常組織與肝癌組織中的基因表達差異情況，見圖5。 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，ESR1、EGFR、MDM2、RELA、PTPRC、AR、MMP9 和MET 基因在正常肝臟組織與肝癌組織中表達具有顯著差異。隨后，通過HPA數(shù)據(jù)庫對蛋白表達情況進行觀察。與正常肝臟組織相比，肝癌組織中ESR1、TNF、EGFR、RELA、JAK2、AR 以及MMP9 蛋白的表達都明顯增加，詳見圖6。

圖5 正常肝臟組織與肝癌組織中的核心靶點的基因表達情況

圖6 正常肝臟組織與肝癌組織中的核心靶點表達情況

2.7 分子對接結(jié)果通過分子對接對木棉花活性成分菠菜甾醇、豆甾醇、槲皮素、4-乙烯基氯芐和橙皮素與ESR1 蛋白進行結(jié)合能的預(yù)測分析。結(jié)果顯示：結(jié)合能分別為-7.1 kcal/mol、-6.9 kcal/mol、-7.7 kcal/mol、-8.0 kcal/mol 和-6.7 kcal/mol，見圖5。木棉花活性成分均與ESR1 蛋白具有較好的結(jié)合能力。

圖5 木棉花活性成分與ESR1 蛋白分子對接結(jié)果

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 是中藥木棉花抗肝癌的重要潛在作用靶點之一?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類能夠降解膠原、纖連蛋白等細胞外基質(zhì)成分（ECM），也能夠在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白。ECM 是阻礙肝癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要屏障，而MMP-9 則可以將ECM 降解，破壞保護屏障，促進肝癌細胞轉(zhuǎn)移與侵襲［5］。同時，MMP-9 蛋白還能夠釋放血管內(nèi)皮因子參與肝癌組織內(nèi)新血管的生成［6］?？傊琈MP-9 與肝癌的進展關(guān)系密切。

女性肝癌發(fā)病率遠低于男性，其可能與雌激素及雌激素信號通路的抗腫瘤作用有關(guān)［7］。雌激素作為內(nèi)源性抗氧化劑能夠抑制肝細胞凋亡，阻斷肝纖維化-肝硬化-肝癌三部曲的發(fā)展［8］。雌激素與雌激素受體（ESR）結(jié)合后激活NF-κB、Bcl-2等下游靶蛋白調(diào)控細胞增殖、凋亡等生物學(xué)活動［9］。雌激素受體目前研究得較為透徹的是1 型（ESR1）與2 型（ESR2），在肝臟中雌激素主要是與ESR1 結(jié)合發(fā)揮活性。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)ESR1 是木棉花活性成分與肝癌交互靶點中評分第一的關(guān)鍵蛋白；在正常肝組織與肝癌組織中ESR1 的基因與蛋白表達具有顯著差異；分子對接驗證發(fā)現(xiàn)，木棉花活性成分與ESR1 蛋白具有較好的結(jié)合活性。以上結(jié)果提示我們，中藥木棉花的抗肝癌作用可能與抑制ESR1 及其相關(guān)信號通路有關(guān)。

簡言之，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出中藥木棉花活性成分菠菜甾醇、豆甾醇、槲皮素、4-乙烯基氯芐和橙皮素，發(fā)現(xiàn)活性成分主要通過ESR1、TNF、EGFR、MDM2、RELA、PTPRC、JAK2、AR、MMP9 和MET 等關(guān)鍵靶點，參與Ras、MAPK、PI3K/Akt 信 號 通 路 發(fā) 揮 抗 肝 癌作用。