韋肖娜 吳劍平 張瑞 李佳佳 甘言剛 楊瓊瓊

急性腎損傷（AKI）是一項嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題［1］。目前，腫瘤的發(fā)病率逐年上升，化療藥物引起的AKI 已經(jīng)成為臨床上亟待解決的突出問題［2］。順鉑（Cis）是目前最常用的化療藥物之一，因其嚴(yán)重的不良副作用包括腎毒性、神經(jīng)毒性及耳毒性，其臨床使用受到限制［3］。目前臨床尚無針對順鉑誘導(dǎo)AKI（Cis-AKI）的有效治療藥物。因此，積極探索Cis-AKI 的發(fā)病機制，開發(fā)針對性治療藥物已成為Cis-AKI 防治的重要手段。生物信息學(xué)分析已被廣泛用于探索一系列疾病的機制。為深入了解Cis-AKI 發(fā)病機制及治療Cis-AKI 的治療藥物靶點，我們從公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）中選取了大鼠Cis-AKI 的微陣列測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選Cis-AKI發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控基因，為加深Cis-AKI 發(fā)病機制的理解和提供潛在的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）篩選Cis-AKI 的微陣列測序數(shù)據(jù)集GSE85957。GSE85957 數(shù)據(jù)集來源于Cis-AKI 的大鼠腎臟的微陣列測序數(shù)據(jù)集，其中疾病組和對照組各5 例。使用GPL1355 平臺對數(shù)據(jù)集進(jìn)行注釋。

1.2 差異基因的篩選在R 軟件中使用limma 包分析Cis-AKI 組與對照組的差異基因（DEGs），DEGs 定義為校正后的P值＜0.05 和∣logFC| ≥1。使用ggplot 包和heatmap 包繪制差異基因的聚類熱圖。

1.3 GO 和KEGG 通路富集分析使用DAVID在 線 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對DEGs 進(jìn)行基因的本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與模塊分析使用STRING 數(shù)據(jù)庫（版本11.0）構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)。所需置信度（綜合得分）＞0.4 是本研究中PPI 網(wǎng)絡(luò)的閾值。Cytoscape用于可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用默認(rèn)參數(shù)（degree cutoff=2、node score cutoff=2、K -core=2、max depth=100）的Molecular Complex Detection（MCODE）模塊和CytoHubba 模塊來篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載GSE85957 的原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行背景校正和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，使用limma 包進(jìn)行DEGs 分析。與對照組相比，Cis-AKI 組共有119 個DEGs，其中上調(diào)的有57個基因，下調(diào)的有62 個基因。采用層次聚類方法，根據(jù)不同樣本中差異基因的表達(dá)值對樣本和基因進(jìn)行聚類，并通過熱圖顯示不同基因在不同樣本中的表達(dá)情況（圖1）。

圖1 Cis-AKI 腎組織和對照組織之間的差異基因表達(dá)

2.2 DEGs 的GO 和KEGG 通路富集分析通過線數(shù)據(jù)庫DAVID 對DEGs 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析分為三個功能組，包括生物過程、細(xì)胞成分組成和分子功能。DEGs 的GO 和KEGG 富集分析的結(jié)果如圖2 所示。在生物過程組中，119 個DEGs 主要富集于細(xì)胞RNA 聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、對刺激的反應(yīng)、晝夜節(jié)律、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等。在細(xì)胞成分組中，119 個DEGs主要富集在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、胞內(nèi)膜界細(xì)胞器和RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等。在分子功能組中，119 個DEGs 主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合和泛素蛋白連接酶結(jié)合等。KEGG 富集通路分析結(jié)果顯示DEGs 主要富集在癌癥中的微小RNA、晝夜節(jié)律、細(xì)胞周期、多巴胺能突觸、FoxO信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和RIG-I 樣受體信號通路。

圖2 119 個DEGs 的GO（排名前10 個類目）分析（A）和KEGG 富集通路分析（B）

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與模塊分析為進(jìn)一步尋找這些差異基因中的關(guān)鍵基因。我們基于STRING 數(shù)據(jù)庫，在Cytoscape 軟件中構(gòu)建了119 個DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。亞網(wǎng)絡(luò)分析得到了5 組基于PPI網(wǎng)絡(luò)MCODE 的顯著模塊網(wǎng)絡(luò)（圖3B-F）。其中模塊1（圖3B）、模塊2（圖3C）和模塊3（圖3D）中富集到的關(guān)鍵基因最多。

圖3A 所有DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，得分＞0.4。每個節(jié)點代表一個基因或蛋白質(zhì)，邊緣代表節(jié)點之間的相互作用.B-FMCODE 選擇的5 個重要模塊的PPI 網(wǎng)絡(luò)。

2.4 關(guān)鍵差異基因的鑒定進(jìn)一步通過結(jié)合Cyto-Hubba 模塊給每個差異基因賦值，定義排名前10 的差異基因為關(guān)鍵差異基因。這些關(guān)鍵差異基因包括Apoptosis enhancing nuclease（AEN）、Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like（ARNTL）、BTG anti-proliferation factor 2（Btg2）、Cyclin G1（CCNG1）、cryptochrome circadian regulator 1（CRY1）、clock circadian regulator（Clock）、D-box binding PAR bZIP transcription factor（DBP）、Fos proto-oncogene（FOS）、nuclear receptor subfamily 1，group D，member 1（NR1D1）和Period circadian regulator 3（PER3）（表3）?；?于Cytoscape 中 的GeneMANIA 插件構(gòu)建和可視化關(guān)鍵差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖4）。該網(wǎng)絡(luò)顯示，這些關(guān)鍵差異基因之間存在強烈的相互作用，它們的相互作用可能對CisAKI 的病理生理過程產(chǎn)生影響。這10 個關(guān)鍵差異基因主要富集在p53 信號通路、細(xì)胞周期和晝夜節(jié)律。

表3 GSE85957 數(shù)據(jù)集DEGs 關(guān)鍵差異基因的表達(dá)情況

圖4 10 個關(guān)鍵差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)（灰度深淺代表得分的高低）

3 討 論

3.1 Cis-AKI 概述AKI 是一項高發(fā)病率、死亡率的全球公共衛(wèi)生問題［1］。AKI 的病理生理學(xué)非常復(fù)雜，但其主要病因是膿毒血癥、缺血和腎毒性。腎毒性主要與藥物的使用有關(guān)。順鉑是最常見的腎毒性藥物和最廣泛使用的鉑類藥物之一，順鉑主要用于各種實體腫瘤（宮頸癌、食道癌、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌和睪丸癌）的化療，是迄今為止使用的最有效化學(xué)療法之一［3］。隨著腫瘤發(fā)病率的逐年升高，Cis-AKI 發(fā)病率居高不下［2］。然而，Cis-AKI的目前尚無針對性的治療措施。因此，積極探索Cis-AKI 的發(fā)病機制，開發(fā)針對性治療藥物已經(jīng)成為Cis-AKI 防治的重要手段，也將為Cis-AKI 的發(fā)病機制提供新思路。目前，測序技術(shù)已被廣泛用于探索Cis-AKI 的發(fā)病機制、診斷和潛在的治療靶點。在本研究中，通過選取GEO 中的Cis-AKI 數(shù)據(jù)集GSE85957 進(jìn)行差異基因分析，聚類熱圖顯示了57 個上調(diào)和62 個下調(diào)的DEGs。在對DEGs 的GO 和KEGG 通路富集分析表明，在Cis-AKI 發(fā)病過程中，許多參與細(xì)胞周期、晝夜節(jié)律、FoxO 信號通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解等細(xì)胞通路的基因被激活。細(xì)胞周期和FoxO 信號通路在AKI 的發(fā)病機制中具有重要的作用已有報道。而晝夜節(jié)律信號通路在AKI 中的作用目前尚未有報道。

3.2 p53 信號通路基因與Cis-AKI為尋找DEGs中的關(guān)鍵差異基因，對這119 個DEGs 進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得分＞0.4（圖3）。進(jìn)一步子網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)5 個重要模塊（圖3）和PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的關(guān)鍵基因（圖4）。這10 個關(guān)鍵差異基因在Cis-AKI 過程中可能非常重要，可用于Cis-AKI 的發(fā)病機制的探索。在關(guān)鍵差異基因中，AEN、BTG2、和CCNG1 是p53 信號通路和細(xì)胞周期蛋白。p53 信號通路基因和細(xì)胞周期蛋白在Cis-AKI的發(fā)病機制中和Cis-AKI 后期的腎臟修復(fù)中有著重要作用，有望成為Cis-AKI 潛在的治療靶點。AEN 即細(xì)胞凋亡增強核酸酶，是p53 下游的靶基因，AEN 的表達(dá)受p53 的磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)。研究表明，AEN 是p53 在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中的重要下游介質(zhì)，是p53 依賴性細(xì)胞凋亡中所必需的［4］。BTG2 是一種p53 誘導(dǎo)基因，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化發(fā)揮其抗增殖作用。Zhang 等人的研究表明，BTG2 表達(dá)較高的腎移植患者標(biāo)本中表現(xiàn)出較差的同種異體移植物存活率，這表明BTG2 可能參與了腎移植后缺血再灌注損傷的發(fā)病機制［5］。CCNG1 即細(xì)胞周期蛋白G1，是細(xì)胞周期蛋白家族的成員，參與DNA 損傷反應(yīng)。Canaud 等人的研究發(fā)現(xiàn)CCNG1 調(diào)節(jié)近端腎小管細(xì)胞中的G2 /M 阻滯，促進(jìn)纖維化和腎臟疾病進(jìn)展［6］。然而，AEN、BTG2、和CCNG1 在Cis-AKI中的作用尚未有報道，這些關(guān)鍵差異基因在Cis-AKI 中的機制需要進(jìn)一步去探索。

3.3 晝夜節(jié)律與Cis-AKI在關(guān)鍵差異基因中，ARNTL、PER3、CRY1、NR1D1 和CLOCK 是晝夜節(jié)律的相關(guān)基因。腎臟本身具有生理性晝夜節(jié)律模式，如尿鈉、鉀、氯化物和磷酸鹽以晝夜節(jié)律模式排出，尿量和pH 值也發(fā)生相應(yīng)變化。Hall 等人揭示了調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的分子機制，并獲得2017 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。事實上，晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)涉及大多數(shù)生物過程，并與人類健康和疾病密切相關(guān)。然而，晝夜節(jié)律相關(guān)基因在Cis-AKI 中的作用未有報道。晝夜節(jié)律紊亂與慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）發(fā)病有著密切的關(guān)聯(lián)。流行病學(xué)研究表明，慢性晝夜節(jié)律紊亂，是包括癌癥和心血管疾病在內(nèi)的許多疾病的高危因素［7］。長期晝夜節(jié)律紊亂會導(dǎo)致患CKD 和高血壓的風(fēng)險增加［7］。晝夜節(jié)律CLOCK 蛋白基因缺失的小鼠比野生型小鼠更容易患腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD［8］。Mishra等人同樣也發(fā)現(xiàn)了在狼瘡腎炎（Lupus nephritis，LN）發(fā)病小鼠和未發(fā)病小鼠中，生物鐘相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的腎臟表達(dá)存在顯著差異。與LN 發(fā)病鼠相比，未發(fā)病小鼠的腎臟表現(xiàn)出正常的ARNTL、CLOCK、PER 和CRY 基因表達(dá)的晝夜節(jié)律模式。與未發(fā)病小鼠相比，LN 發(fā)病小鼠在不同時間點的ARNTL 蛋白表達(dá)也顯著降低［9］。本研究結(jié)果提示晝夜節(jié)律相關(guān)基因在Cis-AKI 的發(fā)生發(fā)展中可能起到關(guān)鍵作用。晝夜節(jié)律相關(guān)基因在Cis-AKI 中的作用機制仍需進(jìn)一步的研究。FOS 是細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)劑。FOS 基因的表達(dá)也與凋亡細(xì)胞死亡有關(guān)。據(jù)報道，F(xiàn)OS 蛋白抑制劑T-5224 可以抑制LPS 引起的AKI［10］，提示著FOS 有望成為AKI 潛在的治療靶點，這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明ARNTL、CLOCK、CRY1、DBP、PER3、NR1D1、CCNG1、FOS、BTG2 和AEN 等基因可能是Cis-AKI 發(fā)病機制中的關(guān)鍵基因及潛在治療干預(yù)靶點，但需要進(jìn)一步的研究及驗證。然而，我們目前的研究仍然存在一些局限性。缺乏人體腎臟組織樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，關(guān)鍵基因在Cis-AKI 中的功能和機制有待進(jìn)一步實驗驗證。