高彥晨，關(guān) 云，張 興

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

在頭頸癌患者的治療中，大約80%的患者都會(huì)接受放射治療[1]。伴隨著放射治療手段方面取得了巨大進(jìn)步，但仍有大量患者出現(xiàn)放療后相關(guān)并發(fā)癥，尤其是頜面部的涎腺組織更容易受到放射損傷，損傷后的腺體唾液分泌變少，引起口腔干燥的臨床癥狀[2-4]。

動(dòng)物疾病模型的建立是研究放射損傷疾病發(fā)病機(jī)制和防治的基礎(chǔ)，從而建立一個(gè)合理的放射損傷動(dòng)物疾病模型對(duì)于本病發(fā)病機(jī)理的研究和預(yù)防有重要意義。現(xiàn)有大量實(shí)驗(yàn)研究都是通過直接照射涎腺組織，且照射劑量與照射方式都不相同，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括小鼠、大鼠及小型豬等，來建立不同的放射損傷動(dòng)物模型[5-9]。頭頸部腫瘤患者在放射過程中，腫瘤是主要放射目標(biāo)，涎腺組織間接在放射過程中受到損傷。因此，如何更好地模擬涎腺的損傷成為一個(gè)難題。本實(shí)驗(yàn)通過建立涎腺放射損傷小鼠動(dòng)物模型，通過唾液流量、腮腺組織HE染色及水通道蛋白1(aquaporin1，AQP1)的檢測(cè)來評(píng)估涎腺組織功能[4，10]，為初步探索涎腺放射損傷治療方法的改進(jìn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

30只健康雌性小鼠，體重(30±2)g，7～8周齡。三溴乙醇(美國Sigma公司)，毛果蕓香堿(北京索萊寶科技有限公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，兔多克隆抗體AQP1(Abcam，美國)，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(北京鼎國生物科技有限公司)，β-Actin兔單克隆抗體(Abcam，美國)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將30只小鼠隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組(5只)、放射組(25只；其中照射8d 8只，照射15d 8只，照射22d 9只)。稱重，根據(jù)小鼠的體重腹腔注射相應(yīng)的1.25%三溴乙醇(15μL/g)麻醉小鼠，以60Co γ射線為放射源，于自制固定罩內(nèi)俯臥固定，照射小鼠頭頸部，照射視野大小2cm×3cm，照射源與小鼠距離80cm，照射參數(shù)為1 250cGy/min，僅暴露小鼠的頭頸部，其余部位用鉛塊遮擋。放射組小鼠分次放射，1次/d，2Gy/次，每周連續(xù)照射5d，休息2d，累計(jì)照射30Gy。對(duì)照組模擬放射組，照射劑量為0Gy。

1.3 唾液收集

分別于照射后第8、15、22d測(cè)量各組小鼠的腮腺唾液，待麻醉完全后經(jīng)頸部皮下注射毛果蕓香堿(1.3μL/10g)，參照Coppes法[11]采集唾液，采集時(shí)間30min。

1.4 組織學(xué)觀察

各時(shí)間點(diǎn)采集完唾液后處死小鼠，將其腮腺組織暴露，分離取出，立即固定于4%多聚甲醛中，制成蠟塊，常規(guī)HE染色，封片。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

取小鼠腮腺組織，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)測(cè)量蛋白含量。以10%多聚丙酰胺凝聚(SDS-PAGE電泳分離)，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移，取出PVDF膜，PBS緩沖液與脫脂奶粉配置成5%封閉液進(jìn)行室溫封閉1h。根據(jù)Marker標(biāo)志切取目的條帶，加入一抗(1∶1 000稀釋)，于4℃孵育過夜，用對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育振蕩1h。ECL發(fā)光液發(fā)光顯色，使用Odyssey紅外掃膜儀顯影并分析結(jié)果；β-Actin作為內(nèi)參照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 小鼠全身情況

放射后第1周各組小鼠飲食、體重及精神狀態(tài)無明顯變化，放射第2周后放射組小鼠飲食、飲水量減少，活動(dòng)度及精神狀態(tài)不佳，頸部毛發(fā)光澤度下降。

2.2 放射對(duì)小鼠腮腺唾液流量的影響

放射后第8、15、22d對(duì)小鼠腮腺唾液流量進(jìn)行收集(表1)。與對(duì)照組相比，放射后第8、15d小鼠腮腺唾液流量沒有明顯差別(P>0.05)；而放射后第22d小鼠腮腺唾液流量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 小鼠放射后唾液流量

2.3 照射后腮腺組織學(xué)改變

腮腺組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)鐖D1所示，對(duì)照組腮腺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，腺葉間有纖維組織間隔，腺泡呈球狀，排列規(guī)則緊密，泡核大且無皺縮。放射第8d腮腺組織結(jié)構(gòu)無明顯變化，而第15d少許腺泡出現(xiàn)收縮、變型。放射第22d組腮腺組織腺泡數(shù)量變少、萎縮且腺泡形狀不規(guī)則，腺葉間纖維化間隙變大，胞漿濃縮，染色加深。

A：對(duì)照組；B：放射第8d；C：放射第15d；D：放射第22d

2.4 Western blot法觀察照射后腮腺組織AQP1的表達(dá)變化

如圖2所示，相比于對(duì)照組、放射第8d和15d，放射第22d腮腺組織AQP1的蛋白表達(dá)水平降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與其他3組比較，*P<0.01

3 討 論

頭頸癌患者的放射治療過程中通常會(huì)有唾液腺腺體損傷的繼發(fā)性副作用，這些副作用一般包括口干癥、口腔黏膜炎和牙周病等，可導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量下降[12-14]。因此，需建立一個(gè)合適的放射損傷模型，來探討放射引起腺體損傷的機(jī)制，為臨床醫(yī)生選擇最佳的放射治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

涎腺的放射損傷程度與放射劑量密切相關(guān)，放射劑量越大，涎腺放射損傷程度越嚴(yán)重。目前大部分損傷模型都是選擇大劑量單次直接照射或分次連續(xù)小劑量直接照射建立涎腺放射損傷模型[6-7，15]。涎腺是外分泌腺，通過產(chǎn)生和分泌唾液經(jīng)導(dǎo)管系統(tǒng)排入口腔內(nèi)，而腮腺是涎腺中最大的腺體，我們通過收集放射治療后腮腺唾液流量來判斷涎腺的損傷程度。在本實(shí)驗(yàn)中，在照射早期，放射組的唾液流量有所下降，但放射后第8d和15d小鼠唾液量較對(duì)照組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而放射后第22d收集到的小鼠唾液流量明顯減少，與對(duì)照組、第8d組和第15d組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過腮腺唾液流量實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)分割小劑量的放射照射到達(dá)一定放射劑量后也會(huì)引起腺體的損傷，導(dǎo)致腮腺的唾液分泌量下降，這與Coppes等[11]的研究放射后前兩期(0～60d)唾液流量持續(xù)降低基本相符。

為了進(jìn)一步揭示小鼠腮腺唾液流量的變化，我們觀察腺體、腺泡及導(dǎo)管在腮腺區(qū)的形態(tài)學(xué)改變。通過對(duì)各組小鼠微觀結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)放射第22d，腺泡數(shù)量變少，腺泡細(xì)胞部分萎縮、消失，導(dǎo)管擴(kuò)張，間質(zhì)纖維化，染色加深。HE結(jié)果進(jìn)一步揭示了放射引起腮腺腺泡數(shù)量的減少及腺泡細(xì)胞的變性和萎縮導(dǎo)致小鼠腮腺唾液流量減少。

AQP1是完整的膜通道蛋白，在水的轉(zhuǎn)移中起重要作用，在體內(nèi)不同組織和細(xì)胞中表達(dá)不同[16]。其中AQP1是一種水跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?，主要參與水從血管通過基底外側(cè)膜向腺泡細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[10]。建模22d后，我們通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)放射組腮腺組織AQP1的蛋白表達(dá)水平降低，提示放射照射影響了AQP1的表達(dá)，繼而腮腺組織的分泌功能受到影響，但本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)放射照射后小鼠腮腺的損傷程度進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的觀察，且其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

模擬頭頸部腫瘤直接照射，分割小劑量的放射照射能引起小鼠腮腺功能及形態(tài)學(xué)明顯變化，小鼠腮腺分割小劑量放射損傷的模型為臨床中放射治療技術(shù)的改進(jìn)提供了一定的理論基礎(chǔ)，而放療技術(shù)的改進(jìn)能更好地提高頭頸癌患者放射治療后的生活質(zhì)量。