李萬順 張德宇 劉月 吳暢 彭立嗣 李詩鈺 楊錚暉 尹華 金震東 黃浩杰

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,上海 200433

【提要】 本文介紹一種迅速、簡(jiǎn)便、產(chǎn)量大、操作難度小的小鼠胰腺腺泡細(xì)胞的分離方法,供胰腺基礎(chǔ)研究者參考。

由于胰腺腺泡細(xì)胞解離時(shí)容易產(chǎn)生和分泌各種消化酶對(duì)自身進(jìn)行消化[1],因此體外原代培養(yǎng)胰腺腺泡細(xì)胞非常困難。1972年,Amesterdam和Jamieson[2]發(fā)明了一種胰腺腺泡細(xì)胞分離并體外培養(yǎng)的方法,但該法操作復(fù)雜,且花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。本課題組前期曾設(shè)計(jì)了一種有效的胰腺腺泡細(xì)胞原代培養(yǎng)方法[3],但產(chǎn)量較低,不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。本研究在此基礎(chǔ)上通過改進(jìn),建立了一種在體外能快速簡(jiǎn)便地分離、培養(yǎng)胰腺腺泡細(xì)胞的方法,旨在為胰腺基礎(chǔ)研究工作者提供參考。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:健康成年野生型C57BL/6黑鼠,體重23～28 g,雌雄不限,由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,第一附屬醫(yī)院消化病研究所專人飼養(yǎng),規(guī)律進(jìn)食和飲水。解離液由Hanks平衡鹽溶液(HBSS)加2.38 g/ml HEPES、200 U/ml膠原酶Ⅳ和0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑混勻配成。緩沖液由HBSS加10%胎牛血清、0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑和2.38 g/ml HEPES混勻配成。培養(yǎng)液由DMEM培養(yǎng)基加0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合物混勻配成。phadebas溶液用14 ml淀粉酶溶液溶解1粒phadebas amylase substrate藥片配制,攪拌后使用。

2．方法:頸椎脫臼法處死小鼠,浸泡在醫(yī)用酒精2 min后固定于超凈工作臺(tái)上。腹部消毒后從小鼠生殖器上部至橫膈膜間剪開一個(gè)V形切口并翻開,將肝葉向上推以充分暴露胰腺和脾臟。用鑷子夾住脾臟和胰腺連接處,拉出胰腺,再用無菌手術(shù)剪刀沿腸道邊緣完整剪下胰腺。將胰腺放入裝有50 ml HBSS的無菌聚丙烯管,去除漂浮的脂肪組織,夾出沉在管底的胰腺組織置于無菌培養(yǎng)皿中,用剪刀和手術(shù)刀將胰腺均勻切成1～3 mm的小塊,然后移至50 ml無菌聚丙烯管內(nèi),4℃下20 g/min離心1 min,棄上層細(xì)胞碎片和血細(xì)胞,沉淀的胰腺碎塊加入8 ml解離液移至細(xì)胞瓶?jī)?nèi),置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min,每隔5 min用3 mm無菌巴氏管來回吹打胰腺碎片10次,并同時(shí)仔細(xì)觀察胰腺狀態(tài)。當(dāng)胰腺組織被完全解離時(shí),加入10 ml預(yù)冷的緩沖液終止反應(yīng),以防胰腺腺泡細(xì)胞被過度消化。再將其移入50 ml無菌聚丙烯管內(nèi),4℃下20 g/min離心1 min,小心吸棄上清后立即加入10 ml預(yù)冷的緩沖液重懸,再在4℃下以20 g離心1 min,吸棄上清,重復(fù)操作3次。將細(xì)胞顆粒重新懸浮于8 ml配好的培養(yǎng)液,并轉(zhuǎn)入裝有100 μm過濾器的50 ml離心管,靜置過濾2 min,吸棄上清,沉淀即為原代胰腺腺泡細(xì)胞。將新鮮提取出來的原代腺泡細(xì)胞接種于6孔板分別培養(yǎng)1、2、4 d,置鏡下觀察腺泡細(xì)胞形態(tài),以未培養(yǎng)的新鮮提取的原代腺泡細(xì)胞為對(duì)照,判斷腺泡細(xì)胞的激活程度。

二、結(jié)果

1．原代培養(yǎng)腺泡細(xì)胞的形態(tài)變化:光鏡下可見新鮮提取的腺泡細(xì)胞光滑且呈圓形,多懸浮在培養(yǎng)基的表面,3～7個(gè)集聚呈團(tuán)狀,周圍無泡狀物。細(xì)胞質(zhì)較為清楚,內(nèi)有大量酶原小顆粒廣泛分布(圖1A)。細(xì)胞碎片和雜質(zhì)較少。培養(yǎng)1 d后,絕大部分細(xì)胞團(tuán)周圍有形態(tài)不規(guī)則的泡狀物產(chǎn)生,此種泡狀物為原代腺泡細(xì)胞激活后而分泌的含有活化的胰酶囊泡,且細(xì)胞周圍分布有大量由原代腺泡細(xì)胞分泌的酶原小顆粒(圖1B)。培養(yǎng)2 d后,泡狀物增大并逐漸趨于圓形,細(xì)胞周圍的囊泡也明顯增多(圖1C)。表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞的活化增強(qiáng)。但培養(yǎng)4 d后,部分原代腺泡細(xì)胞的細(xì)胞膜開始變得不完整,周邊的囊泡也逐漸減少,表明細(xì)胞的分泌能力開始消失,細(xì)胞逐漸死亡(圖1D)。提示本法提取出來的腺泡細(xì)胞能夠在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)存活3～4 d,但培養(yǎng)2 d后,細(xì)胞的分泌能力和極性會(huì)隨著時(shí)間的推移慢慢消失,最終腺泡細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為單層上皮樣細(xì)胞并逐漸死亡。

圖1 新鮮提取的原代胰腺腺泡細(xì)胞(1A)及培養(yǎng)1(1B)、2(2C)、4(1D)d后的腺泡細(xì)胞形態(tài)變化(×40)

2．CCK-8刺激后腺泡細(xì)胞淀粉酶分泌水平的變化:以未加CCK-8刺激的腺泡細(xì)胞分泌的淀粉酶水平為0。CCK-8刺激后,腺泡細(xì)胞分泌的淀粉酶水平隨CCK-8濃度的增加而升高。當(dāng)CCK-8濃度為2.0 mmol/ml時(shí),腺泡細(xì)胞分泌的淀粉酶水平達(dá)到峰值,約為未加CCK-8刺激組的80倍。隨后腺泡細(xì)胞分泌淀粉酶水平下降(圖2)。提示用此種解離方法解離的胰腺腺泡細(xì)胞自激活和受損情況非常輕微。

圖2 不同濃度CCK-8體外刺激胰腺腺泡細(xì)胞30 min后的淀粉酶分泌曲線圖

討論腺泡細(xì)胞構(gòu)成絕大部分的胰腺實(shí)質(zhì),其主要功能是產(chǎn)生和釋放各種消化酶。目前認(rèn)為,胰腺炎的發(fā)生與腺泡細(xì)胞受損密切相關(guān)[1-2,4]。以往已有研究證明,急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制可能是腺泡細(xì)胞自身過度激活,導(dǎo)致其體內(nèi)的各種酶也被激活,然后對(duì)自身腺體進(jìn)行消化[5],因而分離獲取可靠和穩(wěn)定的胰腺腺泡細(xì)胞,可以為胰腺炎的基礎(chǔ)研究提供重要的工具。但是,無論是對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行分離,還是對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng),都較為困難。

在體外,腺泡細(xì)胞容易發(fā)生自激活,對(duì)自身造成損害,并且蛋白酶、鈣離子等螯合劑也會(huì)破壞正常胰腺腺泡細(xì)胞。Dorrell等[6]用熒光激活細(xì)胞分選法(fluorescent activated cell sorting, FACS)對(duì)小鼠胰腺腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管和內(nèi)分泌細(xì)胞成功進(jìn)行分離,但FACS不僅操作繁瑣,且技術(shù)水平要求高,分選出來的腺泡細(xì)胞大多缺失部分初始結(jié)構(gòu)。Gout等[7]使用含有HEPES、膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶抑制劑的Hanks消化液對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行分離,并且在培養(yǎng)液中加入表皮生長(zhǎng)因子,在體外可培養(yǎng)7 d,但該法有3個(gè)明顯缺陷:(1)分離的腺泡細(xì)胞會(huì)在體外逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閷?dǎo)管樣細(xì)胞,導(dǎo)致24 h后無法對(duì)CCK-8做出有效的胰酶分泌反應(yīng)。(2)Ⅰ型膠原酶容易導(dǎo)致腺泡細(xì)胞自激活,表現(xiàn)為在沒有刺激情況下就能夠觀察到原代腺泡細(xì)胞周圍有許多酶原顆粒小泡。(3)在進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)之前,需要將胰腺腺泡細(xì)胞培養(yǎng)1 d,換液之后才能夠進(jìn)行,前期準(zhǔn)備工作復(fù)雜。上述方法較之傳統(tǒng)分離方法而言,都有一定的進(jìn)步,能夠獲得較為理想的胰腺腺泡細(xì)胞,但缺點(diǎn)在于損傷了胰腺腺泡細(xì)胞的部分功能,并且胰腺組織的消化也不夠充分。鑒于此,本課題組前期曾提出一種腺泡提取并原代培養(yǎng)的方法,即采用膠原酶、胰蛋白酶抑制劑溶于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液消化小鼠胰腺,經(jīng)過消化、水浴、重懸、過濾、沉淀等一系列操作,在2 h內(nèi)分離出小鼠原代胰腺腺泡細(xì)胞[3]。但在實(shí)踐中筆者發(fā)現(xiàn),此法雖極大地減輕了胰腺腺泡細(xì)胞的自激活,但有兩個(gè)局限性:(1)產(chǎn)量較低,一只成年C57小鼠僅僅能提取1×106個(gè)左右的腺泡細(xì)胞。(2)無法全部在細(xì)胞間和超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,易導(dǎo)致細(xì)胞污染。本研究采用的改進(jìn)方法是用膠原酶Ⅳ和HEPES配置的HBSS混合溶液在細(xì)胞瓶?jī)?nèi)對(duì)胰腺進(jìn)行消化,并聯(lián)合吸管機(jī)械吹打進(jìn)行解離,解離前后盡量減少離心時(shí)間和離心力,最后通過自然沉淀去除雜質(zhì)。本法能夠減少細(xì)胞碎片和雜質(zhì),降低胰腺腺泡細(xì)胞自激活,故獲得的胰腺腺泡細(xì)胞可直接用來進(jìn)行CCK-8或雨蛙素激活試驗(yàn)。該方法能夠快速從小鼠胰腺成功分離得到較大量(1×107個(gè))的較純的原代未激活的胰腺腺泡細(xì)胞,且過程較其他方法更為簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。

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