曾 鵬 ， 秦曉玥 ， 王義蓉 ， 李穗敏 ， 陳淑貞 ， 鄺素娟 ，楊 慧 ， 饒 芳 ， 鄧春玉 1，，4△

［1華南理工大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510006；2華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；3廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）醫(yī)學研究部臨床藥理重點實驗室，廣東 廣州 510080；4廣東省心血管病研究所心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510100］

年齡相關性心血管疾病常伴隨著血管老化。血管老化能顯著增加年齡相關心血管疾病的風險，如動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病血管病變等［1］。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是動脈中膜的主要組成部分，衰老VSMCs 的積累是導致血管老化的重要原因。年齡、血管緊張素Ⅱ、氧化應激、炎癥和小分子化合物等多種因素均能加速VSMCs 衰老。正常的VSMCs 是靜止的，具有承擔血管收縮功能的收縮表型，能夠有效維持正常的血管結構與功能；衰老的VSMCs 由收縮表型轉化為分泌表型，并釋放大量促炎因子和促重構因子，加重血管的重構及血管硬化，參與血管老化的進展［2］。目前，VSMCs衰老的具體分子機制尚未被完全闡明。

鈣庫操縱性鈣通道（store-operated calcium channels，SOCC）已被證明在免疫細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞等細胞中有表達，并參與調(diào)節(jié)免疫功能、血管收縮和細胞增殖遷移等［3］。鈣感受器基質相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和鈣離子通道蛋白ORAI1 是SOCC 的主要分子基礎。STIM1 主要分布在內(nèi)質網(wǎng)，部分分布在胞膜和微管上，能夠感受內(nèi)質網(wǎng)鈣庫Ca2+耗竭信號，聚集、遷移至細胞膜與ORAI1結合，介導細胞外鈣內(nèi)流，促進血管收縮，并能激活多種轉錄因子，包括SRF、NFAT 和cAMP 等［4］。STIM1 能對高血壓、高糖等多種刺激原發(fā)生反應，并參與高血壓、糖尿病血管病變及心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［5］。下調(diào)STIM1表達能有效控制血管重構及心肌肥厚，但平滑肌特異性STIM1基因敲除（smooth muscle-specificSTIM1gene knockout，sm-STIM1-KO）小鼠的生存率較野生型小鼠顯著下降。STIM1 在阿爾茨海默病模型的神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y 細胞中下調(diào)，體外敲除STIM1基因加速 SH-SY5Y 細胞衰老［6］。但是 STIM1 是否參與血管衰老的進展目前尚不清楚。本研究以STIM1蛋白表達改變?yōu)榍腥朦c，通過過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導的 VSMCs 衰老模型觀察 STIM1表達變化，構建和觀察sm-STIM1-KO 小鼠衰老變化，并在細胞水平干預STIM1 表達變化，探討其在VSMCs衰老中的作用。

材料和方法

1 動物

SPF 級 6~8 周齡雄性 C57BL/6（sm-STIM1-WT）和sm-STIM1-KO 小鼠各20只，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號為SCXK（蘇）2018-0008，在華南理工大學實驗動物中心喂養(yǎng)至20 周后開展實驗。本研究所有動物實驗均已通過廣東省人民醫(yī)院的動物實驗倫理審查（No. GDRE201208a）。

2 主要試劑和儀器

ORAI1 抗 體（13130-1-AP）購 自 Proteintech；STIM1 抗體（#4916）、p53 抗體（#2524）、GAPDH 抗體（#97166）、β-actin 抗體（#4970）和衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染 色 試 劑 盒（#9860）購 自 CST；p21 抗 體（ab109520）和p16INK4a抗體（ab108349）購自Abcam；特級澳洲胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA 購自Gibco；STIM1siRNA（序列見表1）、過表達質粒及腺病毒購自上海吉凱基因有限公司；Lipofectamine 3000 轉染試劑購自Invitrogen；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海醫(yī)用恒溫設備廠）；蛋白電泳儀和轉膜儀（北京市六一儀器廠）；CO2培養(yǎng)箱和 5415D 型微量臺式離心機（Eppendorf）；BS110S 型精密天平（Sartoriu）；垂直電泳儀和Model 680 全自動酶標儀（Bio-Rad）。

表1 STIM1 siRNA序列Table 1. The sequences of STIM1 siRNA

3 主要方法

3.1 構建 sm-STIM1-KO 小鼠 方法如前所述［7］。采用Cre-loxP基因重組技術制備sm-STIM1-KO小鼠。首先培育Tagln-Cre-KI+小鼠與STIM1fl/fl小鼠雜交，導致小鼠平滑肌細胞中STIM1基因的外顯子2 特異性完全敲除，構建sm-STIM1-KO 小鼠，Tagln-Cre-KI+/--STIM1-WT（sm-STIM1-WT）作為對照組。通過PCR檢測雜交小鼠子代鼠尾DNA 提取物基因敲除情況并篩選出sm-STIM1-KO 小鼠。提取小鼠主動脈組織蛋白，Western blot 技術檢測STIM1蛋白水平變化，驗證平滑肌STIM1基因敲除是否成功。

3.2 細胞培養(yǎng)、siRNA 轉染及腺病毒感染 人主動脈 平 滑 肌 細 胞 株 HA-VSMC（CRL-1999 ?）購 自ATCC。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，將細胞放置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞密度增長到70%時，進行傳代。siRNA 轉染前1 d，接種1×105個細胞在含1 mL 完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。125 μL Opti-MEM 無血清培養(yǎng)液和 3 μL siRNA充分混合，靜止5 min。再將125μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)液與3μL Lipofectamine 3000 混合，靜置5 min。將混合轉染試劑與siRNA 稀釋液混合，室溫靜置20 min，將上述轉染混合物加入培養(yǎng)皿中，再補充500μL完全培養(yǎng)液。將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后更換新鮮的培養(yǎng)液。腺病毒感染前1 d，接種1×105個細胞在含1 mL 完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。將含過表達STIM1質粒的腺病毒（5×1012PFU/L）與培養(yǎng)基混合后加入培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Western blot檢測STIM1蛋白表達變化。

3.3 H2O2誘導細胞衰老 方法如前所述［7］，H2O2短時間暴露導致細胞衰老，長時間暴露導致細胞凋亡和壞死。平滑肌細胞傳代至9~12 代開始處理，提前1 d 將每孔1×105的細胞均勻種于6 孔板中。為誘導細胞過早衰老，使用無血清培養(yǎng)液稀釋70% H2O2溶液至200 μmol/L 處理平滑肌細胞，對照組細胞中加入PBS 處理。1 h 后更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h，SA-β-Gal染色檢測細胞衰老變化。

3.4 SA-β-Gal 染色 提前1 d 消化重懸細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞密度70%左右時，按照SA-β-Gal染色試劑盒說明使用。吸去培養(yǎng)液后PBS漂洗3次，加入固定液室溫固定15 min。去除固定液后PBS洗3次，調(diào)整染色工作液pH到6.0，并加1 mL工作液入6 孔板中。密封，避光放入無CO2，37 ℃干燥恒溫孵育箱過夜。在倒置顯微鏡中觀察細胞，衰老的細胞呈現(xiàn)核周藍染，并用ImageJ 6.0 軟件計算染色細胞陽性率。

3.5 Western blot 實驗 從C57BL/6 小鼠中，分離小鼠胸主動脈，去除血管周圍組織和血液，PBS 漂洗3次后加入適量含PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解15 min。在液氮中充分碾磨，收集組織裂解液4 ℃、13 210×g離心15 min，取上清分裝至EP管中。BCA 法測濃度后配成等體積的30μg 蛋白樣品，并加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min。用10%SDS-PAGE 分離蛋白樣品后，轉移至PVDF 膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 洗滌3次，每次15 min。膜同1∶1 000 稀釋Ⅰ抗過夜孵育，后加入 1∶5 000 稀釋Ⅱ抗孵育 1 h。TBST 洗滌 3 次，每次15 min，均勻加入ECL 化學發(fā)光液避光孵育顯影。利用ImageJ 6.0軟件進行灰度分析。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩樣本均數(shù)間比較采用Student＇st檢驗；多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 STIM1 和ORAI1 在H2O2誘導的衰老主動脈平滑肌細胞中的表達

利用H2O2處理平滑肌細胞構建細胞衰老模型，鏡下觀察處理組細胞呈扁平狀、體積增大、顆粒增加，SA-β-Gal 陽性細胞率顯著增高（P＜0.01）；Western blot檢測衰老細胞中SOCC 相關蛋白STIM1和ORAI1的表達變化，結果顯示，與對照組相比，H2O2處理組中 STIM1 和 ORAI1 的 表達顯著下 調(diào)（P＜0.05），見圖1。

2 sm-STIM1-KO小鼠的構建

利用Cre-loxP 基因重組技術構建sm-STIM1-KO小鼠，提取鼠尾DNA 基因組篩選出sm-STIM1-KO 小鼠；HE 染色觀察到sm-STIM1-KO 小鼠主動脈組織結構未見顯著改變；Western blot 結果顯示，sm-STIM1-KO 小鼠主動脈STIM1 蛋白表達基本消失（P＜0.01），平滑肌特異性STIM1基因敲除成功，見圖2。

3 sm-STIM1-KO小鼠主動脈衰老相關蛋白的變化

收集相同月齡（5 月齡）的sm-STIM1-WT 小鼠及sm-STIM1-KO 小鼠主動脈組織，Western blot 檢測組織中 p53、p21 及 p16 的表達變化，SA-β-Gal 染色檢測sm-STIM1-KO 小鼠主動脈細胞衰老變化。結果顯示，與對照組相比，sm-STIM1-KO 小鼠主動脈中衰老相關蛋白p53、p21及p16的表達顯著上調(diào)（P＜0.05），主動脈組織中SA-β-Gal 陽性細胞數(shù)量明顯增多，見圖3。

4 STIM1體外下調(diào)加速平滑肌細胞衰老

我們構建了不同STIM1siRNA 序列，Western blot 顯示 3 條 siRNA 序列均能下調(diào) STIM1 蛋白水平，并在其中選擇效果最佳的STIM1siRNA #3，用于后續(xù)實驗；轉染STIM1siRNA 后，平滑肌細胞中衰老相關蛋白p21 和p16 的表達顯著上調(diào)（P＜0.05），SA-β-Gal染色陽性細胞顯著增加（P＜0.01），見圖4。

Figure 1. Relative protein expression of STIM1 and ORAI1 in H2O2-induced senescent aortic smooth muscle cells. A：Western blot was used to detect STIM1 and ORAI1 expression in H2O2-induced senescent aortic smooth muscle cells；B：the images of SA-β-Gal staining（scale bar=200 μm）and SA-β-Gal positive rate of H2O2-induced senescent aortic smooth muscle cells.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBS group.圖1 STIM1和ORAI1在H2O2誘導的衰老的主動脈平滑肌細胞的表達

Figure 2. Generation of sm-STIM1-KO mice. A：PCR results for the genotyping of mouse tail DNA exaction and Cre-recombinase（P：positive control；WT：wild-type，negative control；N：no-template control；M：D50 DNA marker）；B：histopathological observation of the aorta from sm-STIM1-KO mice（HE staining，scale bar=50 μm）；C：Western blot was used to detect STIM1 protein expression in aortic tissue of sm-STIM1-KO mice. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs sm-STIM1-WT group.圖2 制備平滑肌特異性STIM1基因敲除小鼠

5 STIM1在體外上調(diào)能夠緩解平滑肌細胞衰老

對H2O2處理衰老細胞后進行腺病毒感染過表達STIM1（AdSTIM1+H2O2），Western blot 檢測到平滑肌細胞中鈣感受器STIM1 表達顯著上調(diào)（P＜0.01），而衰老相關蛋白p21和p16的表達顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖5。

Figure 3. The levels of senescence-associated proteins in aortic tissue of sm-STIM1-KO mice. A：the protein levels of p53，p21 and p16 in aortic tissue of sm-STIM1-KO mice were determined by Western blot；B：increased positive cells in the aorta of sm-STIM1-KO mice were observed by SA-β-Gal staining（scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sm-STIM1-WT group.圖3 平滑肌特異性STIM1基因敲除小鼠主動脈衰老相關蛋白的表達

Figure 4. Knockdown of STIM1 promoted senescence of vascular smooth muscle cells（VSMCs）in vitro. A：Western blot was used to detect the protein level of STIM1 in VSMCs after transfected with STIM1 siRNA；B：the SA-β-Gal positive cells were significantly increased after STIM1 knockdown（scale bar=200μm）；C：the levels of senescence-related proteins p21 and p16 in VSMCs after transfected with STIM1 siRNA were determined by Western blot. Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs siNC group.圖4 體外敲減STIM1加速血管平滑肌細胞衰老

Figure 5. Overexpression of STIM1 alleviated senescence of smooth muscle cells（VSMCs）in vitro. After pretreatment with H2O2，the protein levels of STIM1，p21 and p16 in VSMCs transfected with STIM1-overexpressing adenovirus were determined by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs AdCtrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs AdCtrl+H2O2 group.圖5 體外過表達STIM1能夠緩解血管平滑肌細胞衰老

討 論

我們在構建的細胞衰老模型中觀察到，SOCC 的兩個主要組成部分STIM1 和ORAI1 的蛋白水平顯著下調(diào)，進而在體內(nèi)通過平滑肌特異性敲除STIM1 和體外siRNA 干擾細胞的STIM1蛋白表達，顯示STIM1的下調(diào)參與平滑肌細胞衰老的進程。最后我們在H2O2誘導的衰老細胞模型中，通過過表達STIM1，緩解了細胞衰老。

細胞衰老是一個復雜的過程，特征包括細胞生長停滯、細胞凋亡抵抗以及衰老相關分泌表型（SASP）等。年齡、氧化應激、炎癥、藥物及輻射等導致端粒縮短、DNA 損傷激活P53/P21或者P16信號通路導致細胞周期停滯，衰老細胞的β 半乳糖苷酶的活性顯著上調(diào)［8］。與其他衰老的細胞類型相似，衰老VSMCs 的增殖能力顯著降低，VSMCs 轉化為合成表型，對收縮和舒張物質的反應性顯著變化，細胞外基質顯著增加等。雖然到目前為止，VSMCs 的衰老對個體壽命的影響尚未明確，但是可以明確的是VSMCs 衰老能夠加速高血壓、糖尿病和動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展。研究平滑肌細胞衰老的分子機制能夠為治療血管衰老提供新的方向。

細胞衰老與鈣調(diào)控紊亂密切相關，靜息狀態(tài)下衰老細胞胞漿鈣濃度和內(nèi)質網(wǎng)鈣含量增加，線粒體內(nèi)鈣含量減少。STIM1 通過感受內(nèi)質網(wǎng)鈣庫耗竭信號以及各種細胞應激反應介導鈣庫操縱性鈣內(nèi)流（store-operated Ca2+entry，SOCE），并參與細胞增殖、遷移和免疫等基本細胞過程。在體外長期培養(yǎng)的衰老神經(jīng)元模型中可觀察到 SOCE 受損［9］，STIM1 和ORAI1 蛋白水平下降。在阿爾茨海默病細胞模型中，神經(jīng)細胞STIM1蛋白表達水平隨著神經(jīng)變性進展而降低，而敲除SH-SY5Y 神經(jīng)母細胞瘤細胞系STIM1基因，誘導了細胞的衰老［6］。另外，在老年大鼠中SOCC 介導的主動脈血管收縮反應顯著下降［10］，表明STIM1 可能參與血管衰老的進展。而本研究表明，在 H2O2誘導的 VSMCs 衰老模型中，SOCC 相關蛋白STIM1 和ORAI1 表達水平顯著下降。然而STIM1的表達變化是否參與VSMCs 衰老和血管老化發(fā)生、發(fā)展尚不清楚。STIM1基因全身敲除具有胚胎致死性，STIM1基因突變患者常常因為嚴重的免疫缺陷而導致STIM1 在血管中的作用被掩蓋。我們通過CreloxP技術構建了sm-STIM1-KO小鼠模型，能夠觀察在體情況下STIM1敲除對血管功能的影響。與野生型相比，sm-STIM1-KO 小鼠主動脈中衰老相關蛋白p53、p21及p16表達顯著上調(diào)。同時，體外實驗中，敲減STIM1能加速 VSMCs 衰老，而過表達STIM1能抑制H2O2誘導的VSMCs衰老。鈣穩(wěn)態(tài)在衰老過程中被破壞，而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣水平可能影響衰老的進展。文獻報道，L型鈣通道抑制劑硝苯地平處理可通過下調(diào)衰老細胞靜息胞漿鈣水平和提高線粒體鈣含量來改善衰老［11］。然而我們通過敲減STIM1抑制SOCE卻得到了相反的作用，這可能與STIM1對細胞靜息狀態(tài)下胞漿鈣濃度和線粒體鈣含量不同的影響相關。STIM1 除了與質膜Ca2+通道ORAI1 結合，還通過與L型鈣通道蛋白CaV1.2直接相互作用，負調(diào)控其功能。而硝苯地平抑制L 型鈣通道的同時也能夠激活STIM1。H2O2誘導的衰老子宮內(nèi)膜干細胞中，毒胡蘿卜素耗竭內(nèi)質網(wǎng)鈣能夠抑制細胞內(nèi)鈣的上調(diào)，這可能也與 STIM1 的激活有關［12］。STIM1缺陷還能夠通過下調(diào)IP3R3降低線粒體內(nèi)鈣含量，對線粒體的代謝功能產(chǎn)生不利影響。線粒體是氧化磷酸化的主要場所，受損的線粒體能夠釋放大量的ROS 引起細胞內(nèi)氧化還原失衡，并加速細胞衰老。我們的前期研究中觀察到SOCE 能夠通過調(diào)節(jié)線粒體動力學影響線粒體功能［13］。因此，我們猜測STIM1受損可能對細胞正常的鈣穩(wěn)態(tài)，及線粒體功能產(chǎn)生不利影響，但是如何影響細胞衰老的分子機制仍然需要進一步研究。

綜上所述，我們從體內(nèi)和體外兩個方面的研究中發(fā)現(xiàn)，STIM1 對維持血管功能穩(wěn)態(tài)非常重要，下調(diào)STIM1 表達可加速主動脈平滑肌細胞的衰老。我們通過調(diào)控STIM1 的表達觀察到STIM1 與平滑肌細胞的衰老密切相關，這為血管衰老的治療提供了新的靶點。下一步我們將通過分子水平實驗探討鈣感受器STIM1介導細胞衰老的可能機制。