梁 黎， 楊云巧， 朱佳美 ， 潘 婷， 周潤(rùn)蕾， 鄧英蕾， 陳騰祥，，3，郭 兵 ，3， 李海洋 ， 金幫明 ，，3△， 毛大華 △

（1貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，3貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省常見慢性病發(fā)病機(jī)制和藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4貴州醫(yī)科大學(xué)附屬烏當(dāng)醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550502）

乳腺癌是在全世界女性中常見的惡性腫瘤，美國(guó)預(yù)計(jì)每年有超過26.8 萬(wàn)的確診病例，約占女性所有新癌癥病例的30%；在中國(guó)，乳腺癌已成為女性發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤（發(fā)病率為19.2%，死亡率為9.1%）［1-2］，是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。根據(jù)乳腺癌的分子分型將乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A 型、Luminal B 型、Erb-B2過表達(dá)型和三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）［3］。TNBC 是一種雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陰性表達(dá)的乳腺癌［4］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，TNBC 主要發(fā)生在40 歲以下的絕經(jīng)前年輕女性，約占所有乳腺癌患者的15%~20%［5］。與其他亞型乳腺癌相比，TNBC 患者的生存時(shí)間較短，在確診后的頭5 年內(nèi)死亡率為 40%［6］。TNBC 是高度侵襲性腫瘤，約 46% 的TNBC 患者表現(xiàn)為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見于大腦和內(nèi)臟器官，轉(zhuǎn)移后中位生存期僅13.3 個(gè)月，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)25%［7］。由于其特殊的分子表型，TNBC 對(duì)內(nèi)分泌治療或分子靶向治療不敏感?；熓侵饕娜碇委煼椒?，但術(shù)后常規(guī)輔助放化療療效較差，殘留的轉(zhuǎn)移灶最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)［8-9］。因此，迫切需要開發(fā)新的治療方案和尋找新的治療靶點(diǎn)。

多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤1 型（multiple endocrine neoplasia type 1，MEN1）綜合征是由MEN1基因的種系突變失活引起的，主要以甲狀旁腺腺瘤、垂體腺瘤和胰腺瘤等神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤為特征［10-11］。MEN1基因（小鼠為Men1）定位于人類染色體11q13，編碼610個(gè)氨基酸殘基組成的menin蛋白，為多組織表達(dá)的核蛋白。研究表明menin 在肺［12］和前列腺［13］等器官中發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，并在小鼠模型中抑制孕鼠胰腺β 細(xì)胞生長(zhǎng)并加重糖尿病病情［14-15］。研究報(bào)道，女性MEN1綜合征患者呈MEN1基因的純合缺失，提示MEN1是一個(gè)潛在的抑癌因子［16］。然而，有研究顯示，MEN1基因具有促進(jìn)散發(fā)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的功能，menin的過表達(dá)參與乳腺癌細(xì)胞內(nèi)分泌治療抗性的產(chǎn)生［17］，提示在乳腺癌中MEN1通過不同的機(jī)制行使抑癌和促癌的雙重功能。這些研究表明MEN1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用并無(wú)一致定論?；诖?，本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)、臨床乳腺癌樣本、MEN1基因敲除乳腺癌細(xì)胞系統(tǒng)分析MEN1基因在乳腺癌細(xì)胞惡性表型及藥物敏感性調(diào)控中的作用，并闡明其調(diào)控機(jī)制，為以MEN1及其調(diào)控的關(guān)鍵靶基因?yàn)榘悬c(diǎn)開發(fā)乳腺癌治療藥物提供參考資料。

材料和方法

1 臨床組織標(biāo)本

2021 年 3 月~2021 年 8 月 在貴州 醫(yī)科大 學(xué)附屬烏當(dāng)醫(yī)院乳腺外科收集乳腺癌及癌旁組織17 例。所有乳腺癌樣品均從進(jìn)行乳腺癌切除術(shù)的患者中收集，乳腺癌患者經(jīng)病理學(xué)確診，且術(shù)前未接受過放、化療，術(shù)前3 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行過任何藥物治療。本研究獲得所有參與者的知情同意，醫(yī)院倫理委員會(huì)予以批準(zhǔn)通過。每例樣本離體后，保存于液氮中，用于RT-qPCR和免疫組織化學(xué)染色分析。

2 細(xì)胞與試劑

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 細(xì)胞、MDA-MB-468細(xì)胞（TNBC 細(xì)胞）和MCF-7（Luminal A 型）細(xì)胞購(gòu)自ATCC；DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自 Gibco；L-15 培養(yǎng)液購(gòu)自上海源培生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Biological Industries；Trizol 試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海翔圣生物科技有限公司；TB Green Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自Ta-KaRa；CCK-8 試劑盒購(gòu)自 GLPBIO；EdU 試劑盒、Alexa Fluor 555 標(biāo)記驢抗鼠IgG（H+L）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲基硝基亞硝基胍（methyl nitronitrosoguanidine，MNNG）、MI-3 和他莫昔芬（tamoxifen，TAM）購(gòu)自MCE；阿霉素（doxorubicin, DOX）和紫杉醇（taxol，TAX）購(gòu)自大連美倫公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化兔二步法檢測(cè)試劑盒/鼠二步法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋有限公司；抗熒光衰減封片劑購(gòu)自RUITAIBIO；兔多克隆menin 抗體購(gòu)自BETHYL；兔多克隆53BP1 抗體和鼠單克隆RAD51 抗體購(gòu)自NOVUS；鼠單克隆BRCA1抗體購(gòu)自Abcam；鼠單克隆γH2AX 抗體、兔單克隆KU70 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔單克隆Tubulin 抗體購(gòu)自Abcam；0.25%胰蛋白酶、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgGⅡ抗購(gòu)自北京塞維爾公司；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析 從腫瘤基因組圖譜（網(wǎng)址：http：//ualcan.path.uab.edu/）獲得MEN1在人正常乳腺和乳腺癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平以及MEN1在正常乳腺組織、Luminal型、HER2 陽(yáng)性型和三陰性乳腺癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231 細(xì)胞和MDA-MB-468細(xì)胞培養(yǎng)于L-15 培養(yǎng)液，MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素）中，置于37 ℃、5%CO2及完全濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

3.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建MEN1基因敲除的MDA-MB-231 細(xì)胞系 使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建MEN1基因敲除的MDA-MB-231 細(xì)胞系。利用電轉(zhuǎn)法 將 sgRNA 序 列 （5＇-GGCACCAAATTGGACAGCTCCGG-3＇）轉(zhuǎn)染至 MDA-MB-231 細(xì)胞中，挑取單克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)，通過qPCR、基因測(cè)序及Western blot 驗(yàn)證MEN1基因的敲除效率，建立MEN1基因敲除的純合子細(xì)胞，命名為MDA-MB-231/KO，MEN1野生型（MDA-MB-231/WT）細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞。純合子克隆號(hào)為5D3。

3.4 RT-qPCR 乳腺癌及癌旁組織經(jīng)研磨后按照Trizol 試劑說明書提取總RNA，超微分光光度計(jì)測(cè)定A值及RNA濃度，A260/A280的比值在1.8~2.0之間表示RNA 純度滿足實(shí)驗(yàn)需求，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成 cDNA，反應(yīng)條件為 25 °C 5 min；55 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min，合成的 cDNA 置于-80 ℃保存。取2 ng cDNA 進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)，β-actin 上游引物序列為 5’-TCAGAAGGATTCCTATGTGGGCGA-3’，下游引物序列 為 5’-TTTCTCCATGTCGTCCCAGTTGGT-3’；MEN1上游引物序列為5’-ATCACAGGCACCAAATTGGACAGC-3’，下 游 引 物 序 列 為 5’-AACACTACCCAGGCATGATCCTCA-3’。采用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System（Bio-rad）進(jìn)行 RT-qPCR 數(shù)據(jù)分析，結(jié)果經(jīng)內(nèi)參照β-actin校正，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231/WT 和 MDA-MB-231/KO 細(xì) 胞 使 用0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化后，以920×g離心5 min，收集細(xì)胞，用含10%FBS 的L-15培養(yǎng)液重懸，制備成細(xì)胞懸液，按每孔1.5×103個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不加細(xì)胞和藥物的調(diào)零孔。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后加入1μmol/L MNNG、5μmol/L TAM 和0.1μmol/L DOX，按不同實(shí)驗(yàn)要求繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行CCK-8 實(shí)驗(yàn)；吸棄培養(yǎng)液，按每孔 100 μL 的量加入 CCK-8 溶液，終濃度為10%，37 ℃反應(yīng)2 h后，采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)活力［細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（給藥組A值-調(diào)零孔A值）（/空白對(duì)照組A值-調(diào)零孔A值）×100%］；參考文獻(xiàn)［18］采用藥物協(xié)同作用公式計(jì)算聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同作用，q=E（A+B）（/EA+（1-EA）×EB），E（A+B）為藥物聯(lián)合作用的抑制率，其中EA 和EB 分別為單獨(dú)藥物作用組的抑制率，q＞1.15為協(xié)同作用，q=0.85~1.15 為相加作用，q＜0.85 為拮抗作用，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

3.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231/WT 和MDA-MB-231/KO 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，細(xì)胞以每孔1 500 個(gè)接種于含10%FBS的 L-15 培養(yǎng)液的 6 孔板中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 內(nèi)加入 MNNG（1 μmol/L）、TAM（5μmol/L）和DOX（0.1 μmol/L），另加入DMSO 為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)直到觀察到可見的細(xì)胞克隆時(shí)（約8 d）進(jìn)行結(jié)晶紫染色；棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌洗3次，甲醇固定 10 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min，結(jié)晶紫染色15 min，自來(lái)水清洗，晾干后拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

3.7 流式細(xì)胞術(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231/WT和MDA-MB-231/KO細(xì)胞（每孔1×104個(gè)）接種到6孔 板 中 ，24 h 內(nèi) 加 入 5 μmol/L MNNG 處 理 48 h，DMSO 為對(duì)照組；棄掉培養(yǎng)液，PBS 洗滌 3 次，用無(wú)EDTA 的胰酶消化，離心收集細(xì)胞，按照Annexin-V/PI 試劑盒說明書操作，先加入500μL 的Binding buffer 重懸細(xì)胞，再加入 5 μL FITC 標(biāo)記的 Annexin-V 和5μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.8 免疫熒光染色 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231/WT 和MDA-MB-231/KO 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后制備單細(xì)胞懸液，取100μL 接種于蓋玻片上制備細(xì)胞爬片；24 h 內(nèi)加入 5 mmol/L MNNG 作用 12 h。棄掉培養(yǎng)液，用PBS 洗滌3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定 10 min，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；加入 0.1% Triton-X-100 室溫作用10 min，增大細(xì)胞膜的通透性；PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；加入 5% BSA 室溫封閉 1 h；棄掉1% BSA，加入γH2AX 抗體（1∶200，1% BSA稀釋），53BP1 抗體（1∶200，1% BSA 稀釋）4 ℃過夜。PBS 洗滌3 次，每次5 min，加入熒光標(biāo)記的Ⅱ抗IgG（1∶200，5%BSA 稀釋），37 ℃避光孵育 1 h；PBS 洗滌3次，每次5 min；加入20μL DAPI染液進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫避光染色10 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，滴加20μL抗熒光衰減封片劑，倒扣于載玻片上進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下觀察和拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.9 免疫組織化學(xué)染色組織用4%多聚甲醛固定過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋等制備石蠟切片，切片厚度為5 μm；石蠟切片先用二甲苯脫蠟，梯度乙醇進(jìn)行復(fù)水，10 mmol/L 檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中在高壓鍋中水浴15 min 再冷卻至室溫進(jìn)行抗原修復(fù)；用0.3%過氧化氫孵育10 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS 洗滌 3 次，每次 5 min，5% BSA 封閉 30 min；孵育Ⅰ抗，4°C 過夜。PBS 洗滌 3 次，每次 5 min 后在室溫下與Ⅱ抗和標(biāo)記物-HRP 孵育1 h；隨后按照試劑盒說明書進(jìn)行DAB 染色和蘇木精染色；經(jīng)乙醇脫水、二甲苯玻透明、中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察并拍照，使用DigiLabII-Client 軟件在動(dòng)態(tài)顯微鏡上采集染色組織的數(shù)字圖像；IHC 染色定量用IMAGE PRO PLUS 軟件計(jì)算；同一批次樣品的同一指標(biāo)使用統(tǒng)一的量化參數(shù)；所有指標(biāo)均以陽(yáng)性面積表示，參數(shù)為（H：0~30，S：0~180，I：0~180 或H：0~20，S：0~160，I：0~160）；為了自動(dòng)量化每個(gè)樣本的陽(yáng)性細(xì)胞面積，隨機(jī)分析了每個(gè)樣本的3 個(gè)視野（400 倍放大倍數(shù)，800×600像素），計(jì)算每個(gè)樣本的平均值；免疫組化全景掃描采用Motic 顯微鏡和MoticDSAssistant Lite軟件。

3.10 Western blot 將MDA-MB-231/WT 和 MDAMB-231/KO 細(xì)胞和 MDA-MB-468 細(xì)胞消化，離心，收集并重懸，按種至10 cm皿中，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，MDA-MB-231/WT和 MDA-MB-231/KO 細(xì)胞用 5 μmol/L MNNG 作用 24 h，以 DMSO 為 對(duì) 照組 ；MDA-MB-468 細(xì) 胞 用 10μmol/L MI-3作用48 h后再用5μmol/L MNNG單獨(dú)和聯(lián)合作用12 h；吸棄培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，加入RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑），超聲破碎細(xì)胞；4 ℃、13 200×g離心10 min，吸取蛋白上清液，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，95℃金屬浴中10 min；取30 μg 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；10%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別加入Ⅰ抗menin、γH2AX、RAD51、BRCA1、53BP1、KU70 和 KU80，以Tubulin為內(nèi)參，4 ℃下孵育過夜；TBST漂洗20 min×3次；加入山羊抗兔或山羊抗鼠Ⅱ抗（1∶5 000），室溫?fù)u床中孵育 1 h；TBST 漂洗 20 min×3 次，使用 ECL 高敏曝光液，于Tanon 成像儀中進(jìn)行顯影；以ImageJ 軟件測(cè)定條帶的灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值的比值以表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MEN1在乳腺癌組織中高表達(dá)

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，MEN1在乳腺癌患者癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常人乳腺組織（P＜0.05），見圖1A；根據(jù)乳腺癌的分子分型將其分為惡性程度較低的Luminal 型、中等惡性的HER2+型和高度惡性的TNBC型乳腺癌，分析結(jié)果顯示隨著乳腺癌惡性程度的增加，MEN1的轉(zhuǎn)錄水平隨之增加，其中TNBC型乳腺癌中MEN1的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于Luminal 型和HER2+型（P＜0.05），見圖1B。HE和IHC染色結(jié)果顯示，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中menin 蛋白水平顯著升高（P＜0.01），IHC結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致，見圖1C、D。qPCR 結(jié)果顯示，乳腺癌組織中的MEN1mRNA 水平顯著高于癌旁正常乳腺組織（P＜0.01），見圖1E；Western blot 結(jié)果顯示MDA-MB-231細(xì)胞中的menin 蛋白水平顯著高于MDA-MB-468和MCF-7 細(xì)胞（P＜0.01），見圖1F。為了進(jìn)一步闡明MEN1在乳腺癌惡性表型中的具體作用，本實(shí)驗(yàn)采用Crispr/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了 MDA-MB-231/KO 細(xì)胞株，并通過瓊脂糖核酸電泳和Western blot 驗(yàn)證了MEN1的敲除效率，見圖1G~I。

Figure 1. MEN1 is highly expressed in breast cancer tissues. A：transcription level of MEN1 in the normal breast tissues and breast cancer tissues；B：transcription level of MEN1 in normal breast tissues，Luminal，HER2-positive，and triple negative breast cancer（TNBC）tissues；C：HE images，and IHC staining was used to detect the expression of menin in normal breast tissues and breast cancer tissues；D：quantitative analysis of menin IHC staining；E：the mRNA expression of MEN1 in normal breast tissues and breast cancer tissues was detected by using RT-qPCR；F：the expression of menin in MCF-7，MDA-MB-468 and MDA-MB-231 cells was detected by using Western blot and quantified using ImageJ software；G：knockout of MEN1 gene was achieved by using CRSPR/Cas9 technology and verified by sequencing in MDA-MB-231 cell；H：Western blot was used to detect the expression of menin protein in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；I：agarose acid electrophoresis was uesd to verify knockout of MEN1 gene in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；▲▲P＜0.01 vs MDA-MB-231 cells group.圖1 MEN1在乳腺癌組織中高表達(dá)

2 MEN1基因敲除抑制乳腺癌細(xì)胞惡性表型

與MDA-MB-231/WT 細(xì)胞比較，MDA-MB-231/KO 細(xì)胞活力明顯受到抑制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)活力顯著降低（P＜0.05），見圖2A。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究MEN1基因在乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物DOX、MNNG及TAM 敏感性中的作用，克隆形成結(jié)果顯示，MEN1缺失顯著增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)DOX和MNNG的藥物敏感性，且對(duì)MNNG的藥物敏感性最高（P＜0.05），但MEN1缺失不影響MDA-MB-231 細(xì)胞對(duì)TAM 的敏感性（圖2B、C）。EdU 結(jié)果顯示，與 MDA-MB-231/WT 細(xì)胞比較，MDA-MB-231/KO 細(xì)胞中 EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率顯著減少（P＜0.05），DOX 和 MNNG 作用的MDA-MB-231/KO 細(xì)胞中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照 DMSO組（P＜0.05），MNNG 處理的 MDA-MB-231/KO 細(xì)胞的EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于DOX 和TAM組細(xì)胞（P＜0.05），見圖2D、E。

MI-3 是menin-MLL 復(fù)合物的抑制劑，其能破壞menin-MLL 復(fù)合物的穩(wěn)定性從而破壞了menin 蛋白的生物學(xué)功能。CCK-8 結(jié)果顯示，MI-3 對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制呈濃度依賴效應(yīng)，20%抑制濃度為10 μmol/L（圖2F）；克隆形成結(jié)果顯示，MI-3 顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的克隆形成能力（P＜0.05），且具有劑量依賴效應(yīng)（圖2G、H）。本實(shí)驗(yàn)采用MI-3單獨(dú)作用和聯(lián)合DOX、TAX、TAM、MNNG 作用MDAMB-231 細(xì)胞，結(jié)果顯示 MI-3 與 DOX 和 MNNG 聯(lián)合作用能協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，其中MI-3 與MNNG 的聯(lián)合效果最好（圖 2I）；為了探究 MNNG 是如何增強(qiáng)MI-3 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的抑制作用，我們應(yīng)用MNNG 作用MDA-MB-231/WT 和MDAMB-231/KO 細(xì)胞48 h 后運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，DMSO 處理的MDA-MB-231/WT和MDA-MB-231/KO 細(xì)胞凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但MEN1基因敲除顯著增加MNNG 誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡（P＜0.05），見圖2J、K。

Figure 2. Knockout of MEN1 gene inhibits malignant phenotype of breast cancer cells. A: CCK-8 assay was used to detect the proliferation activity of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；B：colony formation assay was used to detect the effects of MNNG，TAM and DOX on the clone formation ability of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；C：quantitation of the colony formation number of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated with MNNG，TAM and DOX；D：EdU staining was used to detect the effects of MNNG，TAM and DOX on the proliferation of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；E：quantitation of the number of EdU positive cells；F：CCK-8 assay was used to the proliferation of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of MI-3 for 72 h；G：colony formation assay was used to detect the colony formation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of MI-3；H：quantitation of colony formation number of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of MI-3；I：MI-3 alone or in combination with MNNG，TAX，DOX and TAM for 72 h，the proliferation activity of MDA-MB-231 cells was detected by CCK-8；J：apoptosis of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated with 5 mmol/L MNNG for 72 h was detected by flow cytometry；K：quantitation of apoptosis rate of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs MENI-WT group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0 μmol/L MI-3 group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs alone group.圖2 MEN1基因敲除抑制乳腺癌細(xì)胞惡性表型

3 MEN1功能異常誘導(dǎo)DNA損傷累積

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與DMSO 處理組細(xì)胞比較，MNNG 作用顯著增加細(xì)胞核中γH2AX 的染色，降低DNA 損傷修復(fù)因子53BP1 的染色（P＜0.05）；重要的是，MEN1敲除顯著增強(qiáng) γH2AX 的表達(dá)以及促進(jìn)MNNG 誘導(dǎo)的γH2AX 表達(dá)（P＜0.01），同時(shí)降低53BP1 的表達(dá)以及抑制MNNG 誘導(dǎo)的53BP1的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3A~D。本實(shí)驗(yàn)對(duì)16 例乳腺癌組織的石蠟切片進(jìn)行連續(xù)切片，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)menin 和γH2AX 的表達(dá)，根據(jù)menin 的表達(dá)水平，采用中位數(shù)切割法分為menin 低表達(dá)組和menin 高表達(dá)組；結(jié)果顯示，menin 高表達(dá)的乳腺癌組織中γH2AX 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而menin 低表達(dá)的乳腺癌組織中γH2AX 的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖3E~G。

4 MEN1 敲除抑制同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)而促進(jìn)非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）修復(fù)

Western blot 結(jié)果顯示，與 MDA-MB-231/WT 相比，MEN1敲除后 DNA 損傷標(biāo)志物 γH2AX 表達(dá)量增加，同時(shí)MEN1缺失促進(jìn)MNNG誘導(dǎo)的γH2AX表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MNNG 顯著促進(jìn)激活HR 修復(fù)通路相關(guān)因子RAD51、53BP1 以及NHEJ通路關(guān)鍵因子KU70 和KU80 的蛋白表達(dá)（P＜0.05）；MEN1基因敲除可顯著抑制 RAD51、BRCA1 及53BP1 的蛋白表達(dá)；相反，MEN1缺失促進(jìn) KU70 和KU80 的蛋白表達(dá)（P＜0.05），見圖4A。本實(shí)驗(yàn)使用MI-3 作用另一株三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468，Western blot 結(jié)果顯示，MI-3 顯著降低 menin 的蛋白表達(dá)（P＜0.05）；與MDA-MB-231結(jié)果類似，MI-3顯著抑制 RAD51、BRCA1 及 53BP1 的蛋白表達(dá)，促進(jìn)γH2AX、KU70 及 KU80 的蛋白表達(dá)，與 DMSO 處理組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4B。

討 論

乳腺癌已成為嚴(yán)重威脅女性健康和生命最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)。TNBC 占所有乳腺癌的9%~16%，好發(fā)于年輕女性［19］。TNBC 侵襲性強(qiáng)，早期復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，無(wú)病生存率和總生存率較低且預(yù)后差［20］。手術(shù)治療、化療和放療是TNBC的常規(guī)治療方法，但“三陰性”的特點(diǎn)使得TNBC 對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感，是Trastuzumab 靶向治療效果不佳的主要原因。免疫治療、分子靶向治療等新興治療藥物正在緊張的研發(fā)中，真正投入臨床應(yīng)用還需要漫長(zhǎng)的時(shí)間。基于此，尋找有效的方法以降低TNBC 的早期復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)其對(duì)放療/化療的敏感性對(duì)于延長(zhǎng)患者無(wú)病生存期和降低患者死亡率具有重要的意義。

MEN1基因突變或功能缺失會(huì)誘導(dǎo)多發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤如垂體瘤、甲狀旁腺瘤、胰島瘤等的發(fā)生發(fā)展，被證實(shí)是一個(gè)MEN1 綜合征關(guān)鍵抑癌基因［10-11］；MEN1通過多種機(jī)制抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移［21］。研究顯示menin/MLL 復(fù)合物與癌基因YAP1啟動(dòng)子結(jié)合增加H3K4me3 修飾，促進(jìn)YAP1基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生［22］，表明MEN1基因在不同組織通過不同的分子機(jī)制行使促癌或抑癌基因的功能。目前MEN1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用并無(wú)一致定論研究報(bào)道，女性MEN1 綜合征患者發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，進(jìn)一步分析顯示這類乳腺癌患者呈MEN1基因的純合缺失，提示MEN1是一個(gè)潛在的乳腺癌抑制因子［16］。然而，MEN1基因具有促進(jìn)散發(fā)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的功能，menin 的過表達(dá)參與乳腺癌細(xì)胞內(nèi)分泌治療抗性的產(chǎn)生［17］，提示在乳腺癌中MEN1通過不同的機(jī)制行使抑癌和促癌的雙重功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MEN1基因在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，提示MEN1在乳腺癌中作為一個(gè)潛在促癌基因促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論，本研究采用CRSPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建MEN1基因敲除的三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MEN1基因敲除顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，表明MEN1基因是一個(gè)乳腺癌促進(jìn)因子。此外，我們采用menin/MLL 復(fù)合物抑制劑 MI-3 作用 MDA-MB-231 細(xì)胞后，通過 CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)和EdU染色均觀察到MI-3顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示menin/MLL 復(fù)合物是menin 行使促乳腺癌功能所必須，其詳細(xì)的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

Figure 3. Knockout of MEN1 gene induces DNA damage accumulation. A：the expression of γH2AX was detected by using immunofluorescence staining in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated by MNNG for 24 h；B：immunofluorescence staining was used to detect the expression of 53BP1 in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated by MNNG for 24 h；C：quantitation of γH2AX expression in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；D：quantitation of 53BP1 expression in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；E：HE images of breast cancer tissues and IHC staining was used to detect the expression of menin and γH2AX proteins in breast cancer tissues；F：quantitation of meninlevels in breast cancer tissues；G：quantitation of γH2AX levels in breast cancer tissues. Mean±SD.**P＜0.01 vs MEN1-WT group；△△P＜0.01 vs menin-high group.圖3 MEN1基因敲除誘導(dǎo)DNA損傷累積

本研究結(jié)果顯示，MEN1基因敲除不影響MDAMB-231 細(xì)胞凋亡，但顯著促進(jìn)DNA 損傷誘導(dǎo)劑MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明在正常情況下MEN1基因不能啟動(dòng)乳腺癌細(xì)胞的凋亡通路，但MEN1缺失能增強(qiáng)由外界刺激啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡，推測(cè)MEN1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞凋亡通路的失活無(wú)關(guān)。有趣的是，MEN1基因敲除能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)DNA 損傷誘導(dǎo)劑MNNG 的敏感性，而不影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)雌激素藥物他莫昔芬的敏感性。普遍認(rèn)為，傳統(tǒng)放化療藥物通過誘導(dǎo)不可修復(fù)的DNA 損傷，主要以DNA 雙鏈斷裂為主從而殺死腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)放化療的治療效果［23］；MNNG 作為一種 DNA 損傷誘導(dǎo)劑，能誘導(dǎo)DNA 堿基突變，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖［24］。我們推測(cè)，MEN1缺失抑制DNA 修復(fù)通路，導(dǎo)致?lián)p傷的DNA 在乳腺癌細(xì)胞中累積從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。研究報(bào)道，menin與DNA損傷修復(fù)因子FANCD2結(jié)合有利于同源重組介導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂修復(fù)［25］。在黑色素瘤細(xì)胞中的研究表明menin/MLL 復(fù)合物與HR修復(fù)因子RAD51C的啟動(dòng)子結(jié)合，增加H3K4me3 的修飾，促進(jìn)RAD51C的表達(dá)從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖［26］。本研究結(jié)果顯示，MEN1缺失抑制 HR 修復(fù)因子 RAD51、BRCA1 及 53BP1 的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)DNA損傷標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)；有趣的是，MEN1敲除反而激活非同源末端連接通路（標(biāo)志物為KU70和KU80），與 Qiu 等［27］在肺癌細(xì)胞中報(bào)道的結(jié)果一致。NHEJ 介導(dǎo)的DNA 損傷修復(fù)會(huì)導(dǎo)致遺傳信息的丟失，是物種多樣性和自然選擇主要原因，NHEJ 作為一種非保真易錯(cuò)的DNA 損傷修復(fù)容易引起DNA 損傷累積［28］。本研究結(jié)果表明，MEN1作為一個(gè)重要的DNA 損傷修復(fù)因子，其功能失活抑制HR 介導(dǎo)的DNA 損傷精準(zhǔn)修復(fù)，激活NHEJ 介導(dǎo)的易錯(cuò)修復(fù)通路，導(dǎo)致DNA 損傷累積，從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)放化療藥物的敏感性。本研究為以menin 及其調(diào)控的DNA 修復(fù)通路關(guān)鍵基因?yàn)榘悬c(diǎn)開發(fā)乳腺癌放化療增敏劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 4. Knockout of MEN1 gene inhibits homologous recombination repair and promotes non-homologous terminal junction repair.A：Western blot was used to detect the expression of γH2AX，RAD51，BRCA1，KU70，KU80 and 53BP1 proteins in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated with 5 mmol/L MNNG for 24 h；B：Western blot was used to detect the expression of γH2AX，RAD51，BRCA1，KU70，KU80 and 53BP1 proteins in MDA-MB-468 cells treated with 10μmol/L MNNG for 48 h. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs WT group；△△P＜0.01 vs DMSO group；##P＜0.01 vs MNNG group.圖4 MEN1敲除抑制同源重組修復(fù)而促進(jìn)非同源末端連接修復(fù)