黃冰鑫 ， 陳 景 ， 吳文濤 ， 周建榮 ， 田 苗 ， 涂賈子超 ，劉 湘 ， 李曉紅 ， 陳寄梅 ，1△

［1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣東省心血管病研究所，廣東省華南結(jié)構(gòu)性心臟病重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510080］

心肌梗死占心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）發(fā)病和死亡的首位［1］。心肌梗死后由于缺血缺氧會導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡并伴有成纖維細(xì)胞增生形成瘢痕組織，導(dǎo)致心室重塑并最終發(fā)展至心力衰竭，給家庭和社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前臨床中主要的治療方式是藥物治療或重建冠狀動脈血運(yùn)［2］，雖然能減少急性期死亡率，但是仍有相當(dāng)大的改善機(jī)會和很多未解決的問題［3］。因此，深入了解心肌梗死的新的細(xì)胞和分子機(jī)制，尋找有效的治療新靶點(diǎn)，對于降低心肌梗死后死亡率、減輕患者和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。

心肌梗死后心肌細(xì)胞的受損主要原因為缺氧缺血（hypoxia-ischemia，HI），在HI 情況下，心肌細(xì)胞會通過死亡受體通路、線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑發(fā)生凋亡。如何有效減少心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌免受HI 損傷是研究的重點(diǎn)。干細(xì)胞的心肌保護(hù)作用已被許多動物研究證實，其中干細(xì)胞分泌的外泌體被認(rèn)為是起作用的主要成分［3］，與干細(xì)胞相比，外泌體在臨床應(yīng)用中具有較多優(yōu)勢，在治療CVDs方面有廣闊前景。但目前關(guān)于人胚胎干細(xì)胞來源外泌體（human embryonic stem cell-derived exosomes，hESCEXO）對心肌細(xì)胞的作用仍不夠明確且研究相對較少，因此本研究選取hESC-EXO 為研究對象，探究其對缺氧人心肌細(xì)胞AC16的作用及可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 H9及AC16細(xì)胞培養(yǎng) 人胚胎干細(xì)胞系H9（購自中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心）接種于Growth Factor Reduced Matrigel 包被的 10 cm 皿 內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。采用PSCeasy 人多潛能干細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，常規(guī)置于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每24 h 換液，密度達(dá)70%以上時收集上清；人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16（購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司）采用含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液常規(guī)置于5%CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，缺氧處理下不添加血清，置于94%N2、5%CO2、1%O2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 外泌體提取及鑒定 將H9 細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移到 50 mL 離心管中，4 ℃、3 000 r/min 離心 10 min，初步沉淀細(xì)胞碎片等雜質(zhì)；取上清液，用30 mL 注射器通過Millex-GP 0.22μm 孔徑過濾膜將其過濾至新的 50 mL 離心管中，再分裝至 Amicon?Ultra-15 離心過濾器中，4 ℃、1 800×g離心40 min 濃縮上清液；取上清液分裝至超高速離心管中，4 ℃、100 000×g離心70 min，棄上清，加入PBS，4 ℃、100 000×g再次離心70 min，棄上清，PBS 洗滌沉淀1~2 次，100 μL PBS 溶解沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，-80 ℃保存。

外泌體樣本用1×PBS稀釋至約1 mL后用納米顆粒跟蹤分析儀（nanoparticle tracking analyzer，NTA）選取合適視野檢測外泌體粒徑，使用Zeta View 8.04.02 分析顆粒直徑及濃度；取5 μL 樣本于銅網(wǎng)上，經(jīng)室溫孵育后加入2%乙酸雙氧鈾孵育1 min，干燥后透射電鏡觀察外泌體形態(tài)；使用RIPA 裂解液、PMSF 及蛋白酶抑制劑混合液提取外泌體蛋白，后續(xù)操作同2.4。

2.2 實驗分組 本實驗將AC16 細(xì)胞于常氧情況下擴(kuò)增后，接種至6 孔板內(nèi)，在缺氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分為缺氧條件加入外泌體組（HI+EXO組）及缺氧條件加入等體積PBS組（HI+PBS組），所用EXO 終濃度為3×109particles/L。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測 （1）MTT 法檢測細(xì)胞活力：將AC16 細(xì)胞等密度接種到96 孔板，每孔體積200 μL（同時設(shè)置純培養(yǎng)基調(diào)零孔，加入MTT 和DMSO），每組設(shè)置4 個復(fù)孔，缺氧狀態(tài)下孵育20 h 后，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后每孔加入100 μL DMSO，搖床上震蕩10 min 使結(jié)晶物充分溶解，在570 nm 處測定吸光度。（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：將缺氧處理后的AC16 細(xì)胞用冷PBS 洗滌2 次，用 1× Binding Buffer 重懸細(xì)胞濃度為 1×109/L，向 100 μL 溶液加入 5 μL PE-Annexin V 和 5 μL 7-AAD；輕輕震蕩細(xì)胞，在室溫、黑暗條件下孵育15 min；再向每個試管中加入400μL 1× Binding Buffer，設(shè)置單染及雙染以調(diào)整補(bǔ)償，1 h 內(nèi)完成流式分析。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位：將試劑盒中提供的CCCP（10 mmol/L）按照1∶1 000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10 μmol/L，常氧下處理細(xì)胞20 min 作為陽性對照組。收集3組細(xì)胞上清，用PBS 洗滌，再用胰酶消化，加入相應(yīng)上清后離心，用DMEM培養(yǎng)基重懸，加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。在孵育期間，配制適量的JC-1染色緩沖液置于冰浴中。37 ℃孵育結(jié)束后，棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，上流式細(xì)胞儀分析線粒體膜電位。

2.4 Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白 提取HI+EXO 和HI+PBS組的蛋白，提取方法同外泌體蛋白提取，應(yīng)用BCA 方法檢測蛋白含量，變性后每孔上樣15 μg，15% SDS-PAGE 分離，再轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上。采用含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液封閉45 min，洗滌3次后加入Ⅰ抗（1∶5 000稀釋），4 ℃搖床過夜。洗膜3 次加入后羊抗兔Ⅱ抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h，洗膜，加入適量ECL 發(fā)光液發(fā)光顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。β-actin為內(nèi)參照。

2.5 hESC-EXO 的全轉(zhuǎn)錄組測序 全轉(zhuǎn)錄組測序委托廣州華銀健康醫(yī)療集團(tuán)股份有限公司進(jìn)行，送去3例hESC-EXO 樣本進(jìn)行測序，構(gòu)建sRNA 文庫與去核糖體的鏈特異性文庫。sRNA 測序文庫可以獲得miRNA 序列信息，去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA 和 circRNA 的序列信息，并進(jìn)行高通量測序。

2.6 定量PCR檢測miRNA表達(dá)情況 Trizol法提取兩組RNA 后，采用miRNA cDNA 第1 鏈合成試劑盒，按說明書配置反轉(zhuǎn)錄體系（加A 尾反應(yīng)法）及設(shè)置反應(yīng)條件得到cDNA，稀釋10 倍使用，得到cDNA 后配制PCR 反應(yīng)液，采用20μL 體系，設(shè)定兩步法進(jìn)行定量檢測，內(nèi)參照使用U6，同時設(shè)置常氧組作為對照組，以計算相對表達(dá)。引物序列見表1。

表1 miRNA引物序列Table 1. Sequences of the primers for miRNA

2.7 miRNA 的生物信息分析 選取miRDB、TargetScanHuman 7.2 和ENCORI 3 個數(shù)據(jù)庫對差異量較高的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測并取交集，對于基因集功能富集分析使用KEGG rest API（https：//www.kegg. jp/kegg/rest/keggapi. html）獲取最新的KEGG Pathway 的基因注釋，以此作為背景，將基因映射到背景集合中，使用R 軟件包c(diǎn)lusterProfiler 3.14.3 進(jìn)行富集分析，以獲得基因集富集的結(jié)果。設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為5 000，F(xiàn)DR＜0.1。對于GO 分析則用 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david. ncifcrf. gov/home. jsp）進(jìn)行分析，通過String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，以獲得對細(xì)胞機(jī)制和功能的全面描述。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胚胎干細(xì)胞來源外泌體的提取及鑒定

NTA 結(jié)果顯示，檢測的外泌體直徑大約在83 nm左右（圖1A）；使用透射電鏡觀察H9 細(xì)胞來源外泌體可見清晰的囊泡結(jié)構(gòu)，呈橢圓形，且大小符合外泌體的檢測標(biāo)準(zhǔn)（圖1B）；Western blot 法檢測外泌體特征性膜蛋白CD9 和CD63 呈陽性（圖1C）。以上特征表明分離得到的囊泡為外泌體。

2 hESC-EXO抑制缺氧AC16細(xì)胞凋亡

MTT 結(jié)果顯示，缺氧的AC16 細(xì)胞加入hESCEXO 后細(xì)胞活力較PBS組顯著增強(qiáng)，見圖2A；PEAnnexin V 的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，HI+EXO組相較于HI+PBS組凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），見圖2B；JC-1 探針流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，HI+EXO組線粒體膜電位較HI+PBS組顯著升高（P＜0.05），見圖2C，表明ESC-EXO 可以減少AC16 缺氧情況下的早期凋亡；與PBS 對照相比，凋亡的標(biāo)志性蛋白caspase-3在外泌體處理后降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 則在外泌體處理后表達(dá)增加，見圖2D。

3 hESC-EXO的全轉(zhuǎn)錄組測序

通過對hESC-EXO 進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建sRNA 文庫，獲得miRNA 序列信息，下機(jī)后進(jìn)行測序數(shù)據(jù)過濾，對比到參考基因組，進(jìn)行sRNA 分類注釋和miRNA 鑒定分析，最后進(jìn)行miRNA 定量分析，選取表達(dá)豐度最高的miRNA 進(jìn)行排序，表達(dá)含量較高的 miRNA 有 miR-16-5p、miR-93-5p、miR-148a-3p、miR-20b-5p、miR-302a-3p、miR-302d-3p、miR-19b-3p、miR-302b-3p、miR-182-5p、miR-101-3p；其中miR-302a/b/d-3p均屬于miR-302簇，為胚胎干細(xì)胞高水平表達(dá)的miRNA，見圖3。

4 ESC-EXO 處 理 后 AC16 細(xì) 胞 的 miRNA 表 達(dá)情況

分別在缺氧處理6 h 和24 h 后提取ESC-EXO 處理的AC16 細(xì)胞的總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行定量PCR 分析，與PBS 對照組相比，測序所得含量較高的miRNA 在EXO 處理后的心肌細(xì)胞中都高表達(dá)，其中尤以miR-302a/b/d-3p表達(dá)顯著升高，見圖4。

Figure 1. hESC-EXO identification results. A：particle size and concentration of exosomes detected by NTA；B：transmission electron microscopic image of exosomes；C：exosome marker protein identification results.圖1 hESC-EXO鑒定結(jié)果

Figure 2. hESC-EXO inhibited apoptosis of hypoxic AC16 cells. A：cell viability was determined by MTT assay；B：cell apoptosis was detected by flow cytometry；C：mitochondrial membrane potential was determined by JC-1 probe and flow cytometry；D：caspase-3 and Bcl-2 expression was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs HI+PBS group.圖2 hESC-EXO抑制缺氧AC16細(xì)胞凋亡

Figure 3. Quantitative rank of miRNA results by hESC-EXO sequencing.圖3 hESC-EXO測序的miRNA結(jié)果定量排序

Figure 4. Expression of miRNA in AC16 cells after hypoxia treated with hESC-EXO. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs HI+BPS group.圖4 ESC-EXO處理缺氧后AC16細(xì)胞的miRNA表達(dá)情況

5 miR-302a/b/d-3p的生物信息學(xué)分析

通過3 個數(shù)據(jù)庫分別對miR-302a/b/d-3p 靶基因取交集后，再對miR-302a/b/d-3p靶基因取交集，得到519 個靶基因，通過GO/KEGG 富集分析及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)miR-302a/b/d-3p 的靶基因主要參與 TGF-β、MAPK 和 PI3K-Akt 信號通路，核心作用的蛋白包括FOXO3、ESR1、RBBP7等，見圖5。

討 論

本實驗通過選取H9 細(xì)胞來源的EXO 作為研究對象，發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)缺氧情況下AC16細(xì)胞的存活，可以抑制線粒體膜電位降低，而線粒體膜電位的下降多出現(xiàn)在細(xì)胞凋亡早期。H9細(xì)胞來源的EXO處理后凋亡時表達(dá)升高的標(biāo)志性蛋白caspase-3 表達(dá)下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示H9細(xì)胞來源的EXO 減少缺氧后的AC16 細(xì)胞凋亡。在對H9 細(xì)胞來源的EXO 進(jìn)行測序后發(fā)現(xiàn)miR-302a/b/d-3p在外泌體中含量較高，且處理AC16細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)miR-302a/b/d-3p 含量也明顯增加，其機(jī)制可能是參與調(diào)控多條凋亡相關(guān)的通路而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

近年來，基于干細(xì)胞的療法已成為CVDs中有應(yīng)用前景的治療策略，其中干細(xì)胞來源的外泌體由于其更安全有效等特性有望成為新的治療工具［5］。外泌體是細(xì)胞內(nèi)吞途徑循環(huán)的最終產(chǎn)物，通過胞吐釋放至細(xì)胞外［6］，富含多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、RNA（mRNA、miRNA 和lncRNA）、DNA（mtDNA、ssDNA 和dsDNA）、脂質(zhì)等［6］，在細(xì)胞間可以發(fā)揮多種生物學(xué)作用。目前已有較多動物實驗證實干細(xì)胞源性外泌體可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥、纖維化、血管生成等治療心梗、心肌缺血再灌注損傷、肺高壓等心血管疾?。?-9］，但研究多集中在間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體以及多以動物源性外泌體進(jìn)行實驗［10］，關(guān)于胚胎干細(xì)胞來源的外泌體則研究較少。本研究主要通過選取人胚胎干細(xì)胞系H9 進(jìn)行研究，作用在人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16上，觀察了其對于缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

因為miRNA 存在廣泛多樣的生物學(xué)功能，以及其在外泌體中的高豐度存在和相對不易降解，所以外泌體研究中又多以miRNA 研究為主。目前有研究確定了外泌體含有的多種miRNA 可以緩解心梗［11-12］、抑制心肌細(xì)胞肥大、抗心肌纖維化、促進(jìn)血管新生等［13］。但對于胚胎干細(xì)胞源外泌體中高豐度表達(dá)的miR-302/367 簇則少有研究提及。本研究所發(fā)現(xiàn)的miR-302a/b/d-3p 均屬于miR-302 簇，不僅在hESC-EXO 中含量較多，且經(jīng)hESC-EXO 處理后AC16 細(xì)胞內(nèi)miR-302a/b/d-3p 含量也明顯增加。多數(shù)研究表明miR-302/367 簇參與多種重要的生物學(xué)過程包括細(xì)胞增殖、分化、重編程、腫瘤發(fā)生、器官發(fā)育、自身免疫以及ESC 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能性維持等［13］。目前miR-302 在心血管領(lǐng)域中的研究并不多見，已發(fā)表的研究主要和Hippo信號通路作用有關(guān)［16］，其具體的作用機(jī)制仍存在爭議［17-19］。在對miR-302a/b/d-3p 進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)其可能作用的核心蛋白FOXO3 是調(diào)節(jié)自噬的主要轉(zhuǎn)錄因子，與凋亡有著密切的聯(lián)系［20］。此外可能作用的MAPK、PI3K-Akt等信號通路也有研究表明可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬［21］，因此hESC-EXO所含的miR-302a/b/d-3p可能主要通過調(diào)節(jié)自噬減少凋亡來完成對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

Figure 5. Bioinformatics analysis results of miR-302a/b/d-3p. A：intersection of miR-302a/b/d-3p target genes in different databases；B：intersection of miR-302a/b/d-3p target genes；C：GO enrichment analysis of miR-302a/b/d-3p；D：KEGG pathway analysis of miR-302a/b/d-3p；E：protein interaction network diagram of miR-302a/b/d-3p target gene，where light blue and pink represent known interactions from professional databases and experimentally determined results，respectively；Green，red，and dark blue represent predicted interactions from gene adjacency，fusion，and co-expression，respectively.圖5 miR-302a/b/d-3p生信分析結(jié)果

綜上所述，hESC-EXO 可以減少心肌細(xì)胞的凋亡，其特殊性高表達(dá)的miR-302簇尤其是miR-302a/b/d-3p可通過外泌體作用到心肌細(xì)胞并產(chǎn)生保護(hù)作用，但具體的作用機(jī)制及靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步的實驗驗證。