劉浩琦1，張涵萊1，2，李媛媛1，宋 珂1，安 娜1，王麗琴1，孫逸坤1，高永紅1?

（1. 中醫(yī)內(nèi)科學教育部和北京市重點實驗室，北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2. 中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京 100700）

腦卒中因其較高的發(fā)病、致殘和病死率而成為臨床中的常見病。在腦卒中疾病中，急性缺血性腦卒中占腦卒中疾病的60%～80%［1］。腦缺血損傷的發(fā)生是一個復雜的過程，其中包含炎癥反應、自由基損傷與細胞凋亡等［2］。代謝組學是能詮釋疾病的病理生理過程并能尋找與疾病相關(guān)的診斷標志物或預后生物標志物的一種技術(shù)。醒腦靜注射液由《溫病條辨》中的《安宮牛黃丸》化裁而來，以冰片、梔子、麝香、郁金四味中藥作為主要成分，具有抗氧化、抗炎等重要作用。已有研究表明，醒腦靜注射液進入人體后能對腦組織發(fā)揮保護作用［3］。課題組既往研究表明，醒腦靜注射液對腦缺血急性期半暗帶區(qū)腦組織具有一定的保護作用，減輕了腦缺血后對微血管、膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元損傷［4］。但在腦缺血再灌注損傷后對代謝物的影響等方面尚未有報道，本研究利用大鼠腦缺血再灌注模型以及代謝組學相關(guān)技術(shù)，探究醒腦靜注射液干預后腦組織內(nèi)源性代謝物的變化和相關(guān)通路，為臨床應用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級 雄 性SD 大 鼠 共 計24 只，體 重（260±10）g，所有實驗動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供（許可證編號：［SCXK（京）2016-0006］）。本實驗中所有的實驗動物被飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物室（許可證編號：［SCYK（京）2015-0001］）。所有動物食水自由并保持墊料清潔。本實驗已通過北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院醫(yī)學與實驗動物倫理委員會審查，且在整個實驗過程嚴格遵守實驗動物管理規(guī)定，動物實驗倫理編號：19-06。

1.2 主要試劑與設(shè)備

醒腦靜注射液（無錫濟民可信山河藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z32020563），栓線（北京西濃科技有限公司，2636-A4），醫(yī)用真絲編織線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司，XS6-0），石蠟切片機、組織包埋機、組織冷臺、組織展片機（Leica/德國），黏附載玻片（福州邁新生物技術(shù)有限公司），光學顯微鏡（Olympus BX60/日本），恒溫加熱儀（HARV ARD/美國），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒創(chuàng)生物科技有限公司），PBS 緩沖液，甲醇、水、正己烷（HPLC級，CNW Technologies），吡 啶、TBSTFA+1%TMCS、97% 的O-甲 基 羥 胺 鹽 酸 鹽、（CNW Technologies），氯仿（AR 級，Titan），11 種脂肪酸甲酯（Larodan、Nc-chek、DR），氣浴恒溫振蕩器（江蘇環(huán)宇科學儀器廠），冷凍濃縮離心干燥器（江蘇太倉市華美生化儀器廠），真空干燥箱（上?；厶┯邢薰荆?，色譜柱DB-5MS（型號：30 m×0.25 mm×0.25 μm），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent/美國）。

1.3 模型制備

線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，術(shù)前禁食不禁水12 h。給予各組大鼠1% 的戊巴比妥（0.5 mL/100 g）劑量腹腔麻醉，術(shù)中置于37 ℃的恒溫毯上密切關(guān)注的各項體征。對大鼠頸部進行備皮消毒，剪開皮膚筋膜使胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌鈍性分離，暴露右側(cè)頸總動脈并將頸外動脈與頸內(nèi)動脈分離至分叉后，頸外動脈近分叉處結(jié)扎并使用電凝器熔斷，在頸外動脈近心端距分叉約4 mm 處剪開切口，插入線栓至頸內(nèi)動脈進線長度距離分叉處約為18～22 mm，出現(xiàn)阻力時停止，使用浸濕生理鹽水的紗布覆蓋傷口，缺血90 min 后拔出栓線灌注后進行結(jié)扎，結(jié)扎后依次縫合頸部皮膚后碘伏消毒，假手術(shù)組大鼠只進行血管分離術(shù)，動物清醒后使用改良神經(jīng)功能缺損評分法評定大鼠神經(jīng)功能，7～12分可視為造模成功［5］。造模成功后將大鼠放置于清潔的鼠籠，使其自由飲食。

1.4 分組與給藥

造模成功后的大鼠每組8 只，隨機分成模型組、醒腦靜組。給藥時間為在造模成功后2 h。將臨床常用量按照體表面積折算后，醒腦靜組以0.18 mL/100 g 的用量腹腔注射藥物醒腦靜注射液。模型組和假手術(shù)組注射同劑量的生理鹽水。各組每日均給藥2 次。

1.5 HE 染色

給藥3 d 后，每組選2 只大鼠麻醉并仰臥固定于解剖板，剪開胸腔使心臟顯露并游離，灌注針從左心室經(jīng)心尖插入主動脈弓，夾閉腹主動脈剪開右心耳，灌注無菌生理鹽水150 mL，至肺臟及前爪顏色變白，灌注4%多聚甲醛150 mL，斷頭取腦24 h 后進行脫水透明與石蠟包埋。石蠟切片機連續(xù)冠狀切片（厚度4 μm），烘烤3 h 后HE 染色?？酒?0 min后將切片置于在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各缸中各脫蠟15 min。移入水化下行的酒精缸與自來水中各5 min。蘇木精染液染色8 min，沖掉多余染液后使用0.5%鹽酸酒精分化10 s，水洗返藍10 min。切片放置于0.5% 伊紅染液色5 min，沖掉多余染液。依次經(jīng)70%、85%、90%、95%、100%Ⅰ、100% Ⅱ酒精缸梯度脫水各5 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明10 min，封片。使用光學顯微鏡觀察梗死區(qū)及周邊腦組織形態(tài)變化并拍攝圖像。

1.6 GC-MS 代謝組學

1.6.1 樣本處理 每組6 只大鼠麻醉后斷頭取腦分離梗死周邊皮層組織，使用0.9%生理鹽水清洗后放入凍存管液氮速凍后進行樣本處理。取30 mg 腦組織加入含有內(nèi)標的離心管，-80 ℃冰箱放置2 min后研磨，加入120 μL 氯仿渦旋混勻2 min，經(jīng)冰浴超聲后提取、靜置、離心吸取上清200 μL。質(zhì)控樣品在離心濃縮干燥機中干燥，加入80 μL 鹽酸吡啶甲氧基胺溶液渦旋振蕩2 min，37 ℃培養(yǎng)箱中與肟反應90 min，加入80 μL 的BSTFA（含1%TMCS）和20 μL 的正己烷，加入10 μL 的11 個內(nèi)標渦旋、反應1 h，室溫放置30 min，進行代謝組學分析。

1.6.2 色譜條件與質(zhì)譜條件 載氣為高純氦氣，DB-5MS 毛細管柱，柱溫箱初始溫度為60 ℃（保持0.5 min），升溫分別為8 ℃/min 至125 ℃、5 ℃/min 至210 ℃、10 ℃/min 至270 ℃、20 ℃/min 至305 ℃（保持5 min）。電子轟擊離子源（EI）離子源溫度為230 ℃，四極桿的溫度為150 ℃，電子能量為70 eV。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（OPLS-DA）對數(shù)據(jù)進行分析。并根據(jù)OPLS-DA 模型所得的變量權(quán)重值（VIP）＞1 和T檢驗所得的概率值P（P＜0.05）為標準，篩選出組間差異性代謝物。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學變化

假手術(shù)組（圖1A）的大鼠腦組織細胞排列致密整齊，其基本形態(tài)結(jié)構(gòu)正常未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變。模型組（圖1B）大鼠腦組織梗死區(qū)出現(xiàn)壞死，細胞排列較為疏松不規(guī)則，細胞出現(xiàn)水腫變性，細胞核出現(xiàn)皺縮。與模型組相比，醒腦靜組（圖1C）大鼠的腦組織結(jié)構(gòu)紊亂減輕，細胞核結(jié)構(gòu)較清晰，核固縮和核溶解程度降低，腦缺血再灌注造成的腦損傷有所減輕。見圖1。

圖1 腦缺血再灌注大鼠術(shù)后3 d 腦組織結(jié)構(gòu)病理變化（HE 染色，×200）Fig 1 Pathological changes of brain tissue structure in rats with cerebral ischemia reperfusion 3 days after surgery（HE staining，×200）

2.2 大鼠腦組織質(zhì)控樣本總離子流疊加圖

通過對比QC 樣品總離子流圖的重疊情況，可得出各峰之間很好地分離，各峰的反應程度和對于時間的保留基本一致。在此基礎(chǔ)上本研究繼續(xù)采用多種分析法對醒腦靜組、模型組、假手術(shù)組之間的差異代謝物進行分析。見圖2。

圖2 大鼠腦組織質(zhì)控樣本總離子流疊加圖Fig 2 Superposition of total ion current in rat brain tissue quality control samples

2.3 PCA 得分圖與其系統(tǒng)穩(wěn)定性分析

PCA 得分圖中的每一個符號點代表一個腦組織樣品，各組樣品在空間分布位置的不同，代表了不同組別樣本的代謝狀況。模型組與假手術(shù)組的位置分布分離趨勢十分明顯，說明采用線栓法大鼠腦缺血再灌注模型大鼠腦組織代謝物產(chǎn)生了較為明顯的差異。醒腦靜組與模型組分離明顯組間差異較大，說明給藥醒腦靜注射液干預后內(nèi)源性代謝物發(fā)生了明顯的改變。見圖3、4。

圖3 模型組與假手術(shù)組的PCA 得分圖Fig 3 PCA score of mode group and sham operation group

圖4 醒腦靜組與模型組的PCA 得分圖Fig 4 PCA score of Xingnaojing group and model group

2.4 正交偏最小二乘方法判別分析（OPLS-DA）

進一步尋找各組間差異變量，用監(jiān)督OPLSDA 分析方法對大鼠腦組織樣品進行分析。OPLSDA 得分圖中模型組與假手術(shù)組、醒腦靜組與模型組的分離顯著，聚類程度較好，說明內(nèi)源性代謝產(chǎn)物在模型組與假手術(shù)組、醒腦靜組與模型組之間存在顯著差異。OPLS-DA 置換圖中R2X與R2Y值越接近1 表明模型擬合數(shù)據(jù)效果越好，且當Q2在Y 軸上的截距小于0 時表明分析模型可靠。OPLS-DA置換圖中，模型組與假手術(shù)組對比R2X=0.853、R2Y=0.997，醒腦靜組與模型組對比R2X=0.788、R2Y=0.887，說明該模型擬合效果良好。模型組與假手術(shù)組對比Q2在Y 軸上的截距=-0.077，醒腦靜組與模型組對比Q2在Y 軸上的截距=-0.097，表明分析模型穩(wěn)定可靠。見圖5、6。

圖5 模型組與假手術(shù)組的OPLS-DA 的得分圖與OPLS-DA 置換檢驗圖Fig 5 OPLS-DA score of model group and sham operation group and OPLS-DA permutation test chart

2.5 差異代謝物分析結(jié)果

醒腦靜組與模型組經(jīng)過分析篩選后得出了12 個差異代謝物，在這些差異代謝物中，上調(diào)的差異代謝物有5 個，下調(diào)的差異代謝物有7 個。上調(diào)的差異代謝物有L-谷氨酰胺、硼酸、亞精胺、氨基甲酸、1，3-二羥基吡啶等代謝物。下調(diào)的差異代謝物有3-氨基異丁酸、天冬氨酸鹽、聯(lián)苯、十二烷醇、胞嘧啶、沒食子酸、黏液酸等代謝物，差異代謝物的結(jié)果見表1。

表1 模型組與醒腦靜組差異代謝物結(jié)果表（n=6）Tab 1 Results of different metabolites between model group and Xingnaojing group（n=6）

2.6 代謝通路富集分析

通過KEGG 代謝物數(shù)據(jù)庫對12 個差異代謝物進行代謝途徑富集分析，得到的路徑分析結(jié)果?？v坐標代表代謝途徑，橫坐標代表富集因子。富集因子的大小顯示出代謝差異物在該條途徑上的富集程度。結(jié)果表明氨基丙酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、嘧啶代謝、組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝等是其重要的相關(guān)代謝途徑。見圖7。

圖6 醒腦靜組與模型組的OPLS-DA 的得分圖與OPLS-DA 置換檢驗圖Fig 6 OPLS-DA score and OPLS-DA replacement test of Xingnaojing and model group

圖7 代謝通路氣泡圖Fig 7 Bubble diagram of metabolic pathway

3 討論

代謝組學是對被干擾或刺激的生物系統(tǒng)的觀察，是對生物體代謝物隨時間變化或代謝物變化的研究。腦缺血再灌注損傷是指腦組織在出現(xiàn)一段時間缺血后，腦組織和細胞的血流量又重新得到恢復，但組織與細胞的損傷程度反而加重的狀況。腦缺血再灌注損傷絕不是一個由單環(huán)節(jié)、單因素、多單途徑參與的作用結(jié)果［6］。大量研究結(jié)果顯示，使用醒腦靜注射液應用于腦缺血再灌注后，具有抑制炎癥與自噬、減輕氧化應激與神經(jīng)損傷以及抑制神經(jīng) 細 胞 凋 亡 等 重 要 作 用［7，8］。本 文 采 用 了HE 染 色法觀察腦組織病理生理變化并基于GC-MS 代謝組學技術(shù)對醒腦靜注射液調(diào)節(jié)代謝物進一步進行探討。HE 染色結(jié)果顯示，模型組的腦組織出現(xiàn)一定程度的壞死、組織細胞排列不齊且出現(xiàn)細胞核皺縮。而醒腦靜組的腦組織結(jié)構(gòu)紊亂明顯減輕，細胞核結(jié)構(gòu)較清晰，核固縮程度也有所降低，提示醒腦靜注射液對大鼠腦缺血再灌注具有保護和改善功能。

代謝結(jié)果顯示，大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織內(nèi)源性代謝物紊亂。其中模型組與假手術(shù)組對比后發(fā)現(xiàn)共有71 個代謝物與腦缺血再灌注有關(guān)，主要參與氨酰生物合成、癌癥的中心碳代謝、淀粉和蔗糖代謝、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、谷胱甘肽代謝、半乳糖代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、果糖和甘露糖的代謝等。在醒腦靜組與模型組的對比中共發(fā)現(xiàn)差異代謝物12 個，涉及β-丙氨酸代謝、嘧啶代謝、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、氮代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、組氨酸代謝、抗壞血酸和阿爾尿酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等多個代謝通路。

氨基酸不僅是作為蛋白質(zhì)的基本組成單位也是人體代謝尤為重要能量來源，其異常情況將直接影響到蛋白質(zhì)的合成與人體的代謝情況［9］。在腦缺血再灌注的病理生理過程中，氨基酸代謝貫穿始終，是其中最為顯著的代謝特征［10］。L-谷氨酰胺作為肌肉和肝臟中最豐富的氨基酸之一，對生長與免疫、抗氧化應激、抗感染與疲勞、維持酸堿平衡等多個方面發(fā)揮著不可忽視的作用［11］。此外，L-谷氨酰胺作為抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的前體，具有抗氧化應激的重要作用［12］。研究證明，L-谷氨酰胺可減少缺血性損傷小鼠的腦梗死體積并具有恢復神經(jīng)行為的效果［13］。本研究結(jié)果顯示醒腦靜組與模型組相比，L-谷氨酰胺明顯上升，說明醒腦靜注射液可能通過L-谷氨酰胺的上調(diào)作用對氨基酸代謝進行調(diào)節(jié)，從而促進腦缺血的改善。

還有一些代謝差異物，也通過氨基酸代謝通路對腦缺血再灌注有所改善，如β-丙氨酸、谷氨酸、精氨酸等。β-丙氨酸是一種非蛋白原性的β-氨基酸，它是已知的含組氨酸的二肽肌肽的限速前體［14］。研究發(fā)現(xiàn)，β-丙氨酸作為一種主要的能源性食物補充劑，能夠通過有效增加肌肉肌肽水平來改善運動表現(xiàn)［15］。谷氨酸作為興奮性的氨基酸，維持著機體的正常運行。部分研究結(jié)果表明［16］高濃度的谷氨酸會過度激活谷氨酸受體，導致血腦屏障的破壞。精氨酸是一種條件性的氨基酸，機體受到損傷發(fā)生病理改變后，精氨酸的水平隨之降低。有研究表明，缺血性腦損傷導致血液和腦脊液中精氨酸含量下降，精氨酸含量與腦梗死和神經(jīng)功能損害呈負相關(guān)［17，18］。亞精胺是哺乳動物組織中的一種氨酸代謝物，并已有研究發(fā)現(xiàn)亞精胺在調(diào)節(jié)血管張力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用［19］。代謝組學結(jié)果顯示，腦缺血再灌注病理過程中伴隨著氨基酸及其衍生產(chǎn)物的水平改變，如在醒腦靜組與模型組的差異代謝物對比中，亞精胺代謝物的水平在醒腦靜注射液干預后有所上調(diào)。說明醒腦靜注射液可促使代謝物的水平趨于正?；?/p>

此外ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、谷胱甘肽代謝也發(fā)揮了重要的作用。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白是現(xiàn)存物種中規(guī)模最大、種類最豐富的超家族蛋白之一，并在細胞穩(wěn)態(tài)、細胞信號轉(zhuǎn)導、藥物代謝和營養(yǎng)吸收等許多生物過程中發(fā)揮著極為重要作用，它們通過限制或減少神經(jīng)毒素在大腦中的積累來發(fā)揮組織保護的生理功能［20］。谷胱甘肽是人體內(nèi)含量最豐富的抗氧化劑，在抗氧化防御系統(tǒng)和維持神經(jīng)元氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用［21］。在本實驗研究的富集通路中發(fā)現(xiàn)醒腦靜組差異代謝物可通過ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、谷胱甘肽代謝等通路對腦缺血再灌注大鼠模型起到調(diào)節(jié)作用。

上述研究表明醒腦靜注射液對腦缺血再灌注大鼠具有良好的治療效果，減少神經(jīng)細胞損傷，通過氨基酸代謝、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、谷胱甘肽代謝等途徑起到調(diào)節(jié)作用。本研究還存在一些不足，需對差異代謝物進行進一步的驗證分析，未來還需要在體內(nèi)外對已發(fā)現(xiàn)的代謝物和途徑以及相關(guān)的生物學過程進行研究。

作者貢獻度說明：

高永紅負責實驗設(shè)計，劉浩琦和張涵萊負責動物造模實驗，李媛媛和宋珂負責病理染色實驗，安娜和王麗琴負責統(tǒng)計，孫逸坤與高永紅負責審校。文章由劉浩琦和張涵萊共同執(zhí)筆，擁有同樣的貢獻度。