孫立旦，楊飛霞，張迪，馬文玥，陳澤良，張志慧，李英俊，史利軍

（1.北京通和立泰生物科技有限公司，北京 102609；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110866；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

硬腦膜是介于顱骨和腦組織之間的一厚而堅韌的雙層膜，其缺損常因開放性顱腦損傷、腫瘤的侵蝕、炎癥的破壞、手術(shù)及先天性疾病等因素造成，硬腦膜缺損處理或修復不當?？蓭韲乐氐暮筮z癥甚至死亡，對患者造成嚴重影響。硬腦膜成形術(shù)在顱頜面整形外科中顱骨缺損的早期和二期修復均為重要操作步驟，硬腦膜缺損的修復材料也直接影響硬腦膜重建后顱內(nèi)感染、癲癇、腦組織膨出、腦脊液漏出等并發(fā)癥的發(fā)生率以及后期顱骨損傷整形修復的美觀［1］。有多種方法可用于修復硬腦膜的修復，包括用自體移植顱骨膜及筋膜修復，有同種異體或異種移植筋膜、顱骨膜及皮膚等組織修復，用加工處理的牛膠原或人類遺體組織修復等［2］。選用左旋聚乳酸（PLLA）材料制備的生物可降解硬腦膜補片是近年來興起的一種有效硬腦膜缺損修補的治療方法。本研究以新西蘭兔為模型動物，評價可降解補片材料的安全性、有效性，預測其在人體中使用時可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，從而降低臨床試驗受試者和臨床使用者的風險，并為臨床試驗方案的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只普通級新西蘭白兔，雌雄各半，體重（3.5±0.25）kg，購于北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心［SCXK（京）2019-0006］。飼養(yǎng)于北京通和立泰生物科技有限公司動物房［SYXK（京）2019-0016］。動物飼養(yǎng)環(huán)境為，室溫20～25℃，濕度40%～70%，10 h 照明，14 h 微光。飼養(yǎng)方式為單籠飼養(yǎng)，每籠1 只，飼養(yǎng)籠具為標準化兔籠。飼喂北京科奧協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的飼料，每只每天分兩次供給其體重5%的飼料，自由飲水。實驗期間遵循3R 原則對動物進行關(guān)懷，所有操作均符合北京通和立泰生物科技有限公司實驗倫理學要求（審批號：IACUC 2017001）。

1.1.2 實驗材料與主要試劑 供試品名稱：可吸收硬腦（脊）膜；供試品號：AN2 017001；批號：20 161112；規(guī)格：60 mm×40 mm；生產(chǎn)廠家：蘇州希普生物科技有限公司。對照品名稱：生物膜人工硬腦膜；批號：0 930119；規(guī)格：40 mm×50 mm；性狀：白色薄片狀材料；生產(chǎn)廠家：北京天新福醫(yī)療器材有限公司。主要試劑：3%戊巴比妥鈉（Sigma,P3761-25g；CAS.Number：57-33-0）；陸眠寧Ⅱ（吉林省華牧動物保健品有限公司，P20160412）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與研究節(jié)點 設(shè)空白組、供試品組和對照品組，每組20 只動物，共60 只。設(shè)4 個研究節(jié)點，分別為30 d、90 d、180 d、300 d。分組后每只動物指定一個單一的實驗動物號。動物及籠卡上標明動物號。分組后用不同顏色籠卡進行組別區(qū)分，并注明實驗編號、供試品名稱、劑量、組別、性別、動物數(shù)等指標。

1.2.2 動物麻醉 動物術(shù)前12 h 禁飼不禁水。動物稱重，先用3%戊巴比妥鈉以0.5 mL/kg 劑量靜脈注射，進行誘導麻醉。3 min 后靜脈注射陸眠寧Ⅱ以0.1 mL/kg 的劑量執(zhí)行。手術(shù)過程中視動物麻醉的深度多次追加首次劑量1/4 的陸眠寧Ⅱ。術(shù)前于耳緣靜脈采血2 mL，用于測定血相和血清生化。每只動物肌肉注射氨芐西林20 萬IU，慶大霉素4 萬IU 用于抗感染。

1.2.3 補片植入 實驗方法參照文獻［3-8］，并根據(jù)臨床實際情況制定。兔頭固定于頭架上，嚴格執(zhí)行備皮消毒等無菌術(shù)后，于顱頂正中偏左腦處行縱行切口，長約3 cm。依次切開皮膚及皮下組織，鉗夾止血，切開并剝離骨膜，打開顱骨并盡可能保留顱骨完整，切口長約1.5 cm，寬約1.5 cm。充分暴露硬腦膜，腦膜剪在骨窗內(nèi)剪出1.0 cm×1.0 cm 圓形硬腦膜缺損，操作時切勿損傷腦組織。將供試品組或?qū)φ掌方M硬腦膜補片修剪為相應(yīng)形狀，貼附于腦表面，硬腦膜補片與缺損處邊緣重疊約0.3 cm。植入完成后骨瓣放回原位固定，縫合筋膜和頭皮，紗布包扎傷口。手術(shù)結(jié)束后普通飲食飼養(yǎng)，未給予止痛藥物，術(shù)后1～3 d，青霉素20 萬u/次，1 次/d，肌肉注射?？瞻捉M20 只，僅用生理鹽水處理。供試品組20 只，利用可吸收硬腦膜補片治療動物模型硬腦膜。術(shù)后標本獲得：術(shù)后分別在30 d、90 d、180 d 時間點處死動物，獲取不同供試品組治療后的硬腦膜標本。標本獲得后，首先觀察標本橫切面大體外觀，再進行病理切片制作。

1.3 觀察指標

1.3.1 術(shù)后動物情況觀察 術(shù)后動物基本觀察指標包括：手術(shù)期死亡情況、傷口感染、運動障礙、精神異常、腦脊液漏。大體觀察包括：創(chuàng)面愈合、腦脊液滲漏、補片降解及腦組織粘連等。

1.3.2 血液及生化指標檢測 分別于術(shù)前及術(shù)后不同研究節(jié)點耳靜脈采血，分析血常規(guī)及生化指標。

1.3.3 組織學觀察 通過蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察，比較兩組的手術(shù)周圍組織反應(yīng)情況。評價內(nèi)容包括粘連情況、纖維增生情況、血管密度和材料降解情況等。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后動物大體情況

供試品組和對照品組動物無死亡，空白組死亡3 只。供試品組1 例發(fā)生切口感染，對照品組2 例發(fā)生切口感染，空白組5 例發(fā)生切口感染，治療后均好轉(zhuǎn)。供試品組和對照品組均未見腦脊液滲漏、癲癇、精神異常和運動障礙等情況的發(fā)生。見表1。

表1 術(shù)后動物大體情況（n=20,例）

2.2 術(shù)后局部愈合情況

術(shù)后30 d 供試品組和對照品組硬腦膜均愈合良好，無膿腫、無皮下積液，兩組補片均與周邊硬腦膜形態(tài)連續(xù)，能完整封閉硬腦膜缺損，無腦脊液漏，可辨認出補片邊緣；補片與腦組織容易分離，腦組織局部均無受壓、充血和水腫，局部無膿腫及滲出。術(shù)后90 d，取材可見顱骨瓣與頭骨之間的縫隙已經(jīng)為纖維瘢痕組織所替代，兩組補片均出現(xiàn)部分降解，與周邊硬腦膜融合，補片與腦組織均無明顯粘連。術(shù)后180 d，兩組補片均大部分降解，補片邊緣與周邊硬腦膜不能辨別。見圖1。

圖1 植入后30 d、90 d、180 d 局部創(chuàng)面恢復情況

2.3 血常規(guī)血清生化指標檢測

中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞和血小板在各個研究節(jié)點數(shù)量的變化與植入前比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶（γ-GT）、血清球蛋白（GLB）、血清白蛋白（ALB）和肌酸激酶（CK）在各個研究節(jié)點含量的變化與植入前比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

2.4 病理檢測

術(shù)后30 d 兩組鏡下尚可辨認出補片邊緣，補片內(nèi)部可見淋巴細胞和單核細胞浸潤，表現(xiàn)出輕微炎癥反應(yīng)，腦室區(qū)和腦實質(zhì)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)正常，均未見明顯炎性細胞浸潤，與補片均未見明顯粘連；補片表層可見成纖維細胞增生，并可觀察到新生血管。術(shù)后90 d 兩組鏡下均不能辨認出補片邊緣，補片與硬腦膜組織完全融合，偶見淋巴細胞，補片內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散，可見纖維碎片，提示補片已被宿主細胞降解；“碎片”之間可見成較多纖維細胞，可見新生血管。補片內(nèi)側(cè)面可見內(nèi)皮細胞覆蓋，局部腦組織正常，蛛網(wǎng)膜正常。術(shù)后180 d，兩組補片內(nèi)部均未見炎性細胞，補片內(nèi)部成纖維細胞密度增高，新生膠原纖維排列規(guī)則，新生血管密度增加，未見明顯瘢痕組織，硬膜內(nèi)側(cè)面內(nèi)皮細胞密度增高，排列規(guī)則。見圖2。

圖2 病理組織學檢測（HE×100）

3 討論

PLLA 因其無毒性、無害，具有較好的生物相容性和生物可吸收性，是經(jīng)美國食品及藥物管理局（FDA）批準的能夠作為植入人體的生物材料，已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域熱門的研究材料［9-10］。含PLLA 成份的生物可降解硬腦膜補片在物理性能上接近人體正常硬腦膜，能夠保證手術(shù)縫合時不脫邊、不撕裂，且能隨顱內(nèi)壓的變化而有一定的彈性伸縮。該類補片在整體保留良好力學性能的同時，通過分層結(jié)構(gòu)讓材料的內(nèi)表面減少與腦組織的粘連，中間層起到加固和防水作用，外層含有膠原成分發(fā)揮生物活性并促進組織再生。新型補片分層結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面能減少與腦組織的粘連，中間層起到加固和防水作用，外層含有膠原成分發(fā)揮生物活性并促進組織再生。故該型補片對于硬腦膜缺損的修補，維持解剖學的完整和保護腦組織是十分重要的［11］。

本研究結(jié)果顯示，含PLLA 成份的補片能夠主動誘導成纖維細胞增生分化，促進新生血管生成，形成排列規(guī)則、致密的纖維層，并誘導內(nèi)皮細胞增殖，形成完整的內(nèi)皮層，與腦組織無粘連反應(yīng)，形成完整的蛛網(wǎng)膜下腔。在上述修復過程中，試驗樣品與對照樣品無明顯差異。組織病理學檢測結(jié)果顯示，兩組樣品植入后30 d 可觀察到補片內(nèi)部存在少許炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，補片周圍組織無明顯炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，植入后90 d 炎細胞浸潤基本消失。結(jié)果表明，植入初期的炎細胞浸潤可趨化成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞長入，并與材料降解密切相關(guān)。組織病理學檢測結(jié)果顯示，兩組樣品植入后30 d 即出現(xiàn)成纖維細胞增生，并可觀察到補片纖維碎片，植入后90 d，可觀察到規(guī)則致密的纖維層和松散的補片纖維同時存在，術(shù)后180 d 時可觀察到補片基本完全降解。

綜上所述，經(jīng)試驗測試的含PLLA 成份的生物可降解硬腦膜補片局部修復效果良好，無滲漏情況的發(fā)生，且最后完全降解吸收，無材料殘留。因此該含有PLLA 成份的生物可降解硬腦膜補片將會成為硬腦膜修復理想的新型材料。