陳久兵，耿尚景超，，王方國，，陳婭婷，周金偉，駱 巧，馬 莉，姚學(xué)萍，余樹民，沈留紅，儲岳峰，曹隨忠，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730046； 3.蒲江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 蒲江 611630)

牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease， BRD)俗稱運(yùn)輸熱，是由多種因素相互作用形成的呼吸系統(tǒng)疾病，包含環(huán)境因素(如斷奶、運(yùn)輸、混群、擁擠和通風(fēng)不良)，宿主自身因素和病原體等。由于此疾病與動物福利和高昂的經(jīng)濟(jì)成本相聯(lián)系，國外對其進(jìn)行了大量的研究，已證實(shí)其病原包括病毒、細(xì)菌和支原體等。其中常見的細(xì)菌性病原包含: 多殺性巴氏桿菌(，)、睡眠嗜血桿菌(，)、牛支原體(，)、化膿隱秘桿菌(，)和溶血性曼氏桿菌(，)等；病毒性病原主要包含：牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV)、牛副流感病毒3型(bovine paraffin virus 3， BPIV3)、牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus， BRSV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus， BVDV)等。通常情況下，上述病原常形成混合型感染，因而往往需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷才能確定病原體類型。

我國對BRD的相關(guān)研究起步較晚，國內(nèi)關(guān)于奶牛BRD病原流行病學(xué)資料較少，2013—2015年張曉宇對我國西南、華南、華東、華北、華中和西北6個(gè)區(qū)域的集約化牧場進(jìn)行牛呼吸道疾病流行情況調(diào)查，對80日齡以內(nèi)的犢牛進(jìn)行鼻拭子采樣，并記錄臨床癥狀、發(fā)病日齡、發(fā)病率和病死率等，結(jié)果顯示，BRD發(fā)病率隨著日齡增長呈波浪形變化，發(fā)病第一個(gè)高峰出現(xiàn)在20～40日齡，發(fā)病率為62.49%，第二個(gè)高峰出現(xiàn)在犢牛斷奶前后(60～80日齡)，發(fā)病率為59.44%。根據(jù)2007年美國動物健康監(jiān)測系統(tǒng)調(diào)查(NAHMS)顯示，奶犢牛斷奶前的感染率為12.4%～16.4%，斷奶后呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率為5.9%，是小犢牛死亡的主要原因(46.5%)。

不同國家和地區(qū)BRD暴發(fā)流行的病原微生物種類差異很大， 目前實(shí)驗(yàn)室檢測BRD的方法有血清學(xué)檢測、病原分離培養(yǎng)和PCR檢測等，但大多數(shù)檢測都是基于一種測定方法檢測一種病原體，缺乏快速診斷的全面性。TaqMan熒光定量PCR檢測方法是在RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸檢測方法，具有快速、敏感、準(zhǔn)確、定量檢測微生物核酸拷貝數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)參照Kishimoto等、Sachse等報(bào)道的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，選擇、、、和保守性和特異性較好的基因片段進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)，根據(jù)翟肖輝等、王方國研究中建立的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，對該5種常見BRD細(xì)菌病原進(jìn)行檢測。本研究利用該檢測技術(shù)對四川某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場BRD病原分子診斷，了解該牧場BRD相關(guān)致病性細(xì)菌病原的種類，為臨床治療與防控提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源及采集時(shí)間

2019年4、11月和2020年4月采集四川省某規(guī)模化奶牛場(存欄數(shù)2 199頭，泌乳牛只1 127頭)患有BRD的犢牛鼻腔棉拭子(分3批次共75份)和牛舍墊料、糞水、牛奶、水槽飲用水、料槽飼草混合物樣品(各2份，均采自飲奶犢牛舍)，共85份，于-20 ℃保存。患有BRD犢牛的臨床表現(xiàn)為不同程度的流鼻涕、咳嗽、精神沉郁、食欲下降、呼吸困難等。

1.2 主要試劑與儀器

CFX96熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國)，質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA Endo-free Plasmid Mini KitⅡD6950-01)購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司，2×Goldstar TaqMan Mixture購自康為世紀(jì)有限公司，DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，DP301-02)購自北京天根科技有限公司。

1.3 DNA的提取

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取所有樣品DNA，具體操作參考說明書，DNA于-20 ℃保存。

1.4 引物與探針

參照Kishimoto等、Sachse等報(bào)道的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，由西安擎科生物有限公司分別合成、、、和相應(yīng)引物和探針，引物探針信息見表1。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中已公布的、、、和全基因序列，引物所處的位置和擴(kuò)增目的條帶長度，使用CloneManager8.0軟件進(jìn)行分析查找，選取擬擴(kuò)增目的基因序列，合成并克隆到質(zhì)粒載體pUC57，克隆位點(diǎn)Eco RV，載體長度2.7 kb，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成、克隆。具體序列見表2。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)翟肖輝等、王方國研究中設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，用Elution Buffer緩沖液將各重組質(zhì)粒分別做10×倍比梯度稀釋、使其濃度分別為1×10～1×10拷貝·μL作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系: 2×Goldstar TaqMan Mixture 10 μL，ddHO 7.5 μL，引物F(10 μmol·μL)0.5 μL，引物R(10 μmol·μL)0.5 μL，探針(10 μmol·μL)0.5 μL，模板1 μL。 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min后，再95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值Log()為軸，以Ct值為軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 qPCR檢測的引物探針組

表2 目的基因序列

1.7 病原檢測

參照文獻(xiàn)[2，6-8]報(bào)道的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法分別對、、、和進(jìn)行檢測，陽性判定：Ct值≤10拷貝數(shù)，陰性判定：Ct值>10拷貝數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算各病原菌的檢出率、單一感染率及混合感染率。其中“某菌檢出率”指某細(xì)菌所有檢出樣本數(shù)/總樣本數(shù)，包括混合感染中該菌的檢出樣本數(shù)。而“單一感染率”指某一細(xì)菌單獨(dú)檢出樣本數(shù)/總樣本數(shù)，不包括混合感染中該菌的檢出數(shù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率進(jìn)行評價(jià)。各質(zhì)粒擴(kuò)增效率分別在90.1%～100.3%，相關(guān)系數(shù)值為0.990～0.999。由此可見，各質(zhì)粒濃度(拷貝數(shù))與Ct值之間存在較好的線性關(guān)系。同時(shí)經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所翟肖輝等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有良好的特異性和敏感性。

2.2 病原檢測結(jié)果

對75份鼻腔棉拭子樣本中5種常見細(xì)菌性病原的檢測結(jié)果顯示，、、、和的檢出率分別為 57.33%(43/75)、38.67%(29/75)、13.33%(10/75)、12.00%(9/75)、8.00%(6/75)。單一感染率為36.00%(27/75)，主要由引發(fā)，占24.00%(18/75)；混合感染率為 40.00%(30/75)，尤以和引發(fā)的混合感染為主，占18.67%(14/75)。75份樣本中有18份樣品未檢出任何病原菌。在10份其他樣本中有一份草料檢測到了。單一或者混合感染率以及各細(xì)菌檢出率檢測情況見圖1。

橫坐標(biāo)表示各細(xì)菌檢出率；縱坐標(biāo)柱狀圖代表感染率，每一行圓圈對應(yīng)該行左側(cè)相應(yīng)細(xì)菌(灰色圓圈無代表性，圓圈顏色不特指某一細(xì)菌)，其對應(yīng)縱坐標(biāo)為感染率，兩個(gè)圓圈或多個(gè)圓圈相連表示相應(yīng)細(xì)菌間的混合感染情況。The abscissa indicated the detection rate of each bacteria. The vertical coordinate represented the infection rate， and each circles represented the corresponding bacteria on the left side of the row (the gray circle was not representative， and the color of circle did not refer to a particular bacteria)， that corresponding ordinate was the infection rate， and the connection of two or more circles indicated the mixed infection among the corresponding bacteria.圖1 TaqMan-PCR檢測方法對臨床樣品的檢測情況Fig.1 The detection of clinical samples by TaqMan-PCR method

3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣檢測結(jié)果如表3所示，不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌檢出率最高的分別是和。2020年4月檢出率高于2019年4月和11月，有升高的趨勢(>0.05)。2019年4月和11月檢出率極顯著高于2020年4月(<0.01)，2019年11月檢出率顯著高于2020年4月(<0.05)，2019年4月檢出率顯著高于2020年4月(<0.05)，、、3種細(xì)菌檢出率隨采樣時(shí)間的推移均呈下降趨勢。

表3 不同采樣時(shí)間qPCR檢測結(jié)果

3 討論

BRD是由一系列感染因子和環(huán)境因素引起的一種牛呼吸系統(tǒng)疾病，對全世界養(yǎng)牛業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。一般認(rèn)為細(xì)菌和支原體能加重BRD的暴發(fā)，當(dāng)病毒感染牛呼吸道后，造成牛呼吸道上皮細(xì)胞受損和牛免疫系統(tǒng)受到抑制，從而細(xì)菌和支原體等病原體侵入牛下呼吸道，引起繼發(fā)感染。同時(shí)某些細(xì)菌又能幫助BRD病毒逃避宿主防御，促進(jìn)肺損傷，導(dǎo)致疾病加重。

和屬于條件性致病菌，在本次鼻拭子檢測中這兩種病原菌的檢出率分別高達(dá)57.33%和38.67%，且該兩種細(xì)菌的混合感染率達(dá)18.67%，為主要混合感染模式。以其莢膜抗原和菌體抗原分血清型，國內(nèi)牛源的以B:2型引起牛出血性敗血癥為主，近年發(fā)現(xiàn)A:3型是BRD中最常見的血清型。國內(nèi)外可應(yīng)用的疫苗主要是鏈霉素依賴的突變體研制的活疫苗和傳統(tǒng)方法研制的滅活疫苗，但免疫保護(hù)率較低，且該菌B型疫苗對A型菌無交叉保護(hù)作用，加大了該菌的防控難度，使其在我國各養(yǎng)牛省區(qū)的檢出率均較高。本研究3次檢測中也有逐次遞增的趨勢，這種轉(zhuǎn)變的潛在原因可能是該菌的毒力增強(qiáng)、牧場對生病犢牛識別和管理不當(dāng)以及抗菌藥物的選擇不適等。多存在于犢牛的鼻咽區(qū)和下呼吸道，能與BRSV協(xié)同作用，促使肺泡細(xì)胞收縮和膠原蛋白降解增加，導(dǎo)致肺組織損傷加劇。在表現(xiàn)健康的犢牛呼吸道中能檢測到該菌，但BRD牛群的檢出率和病原濃度要明顯高于正常牛。是國外引起B(yǎng)RD的重要病原菌，在巴西BRD牛中陽性率達(dá)39%，但國內(nèi)少見與BRD相關(guān)的報(bào)道。本研究中為第二大優(yōu)勢菌，檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了張穎慧等進(jìn)行的四川省11個(gè)外地引種牛場該菌的檢出率(5.6%)，可能原因是本實(shí)驗(yàn)采用的TaqMan熒光定量PCR方法比普通PCR及細(xì)菌分離培養(yǎng)方法敏感。同時(shí)表明該菌在我國可能廣泛分布，有必要進(jìn)一步開展其流行病學(xué)調(diào)查。

在此次檢測中的陽性率為13.33%，低于西南三區(qū)(四川、重慶和昆明)39.37%。可能與本次檢測僅在四川特定牛場特定時(shí)間段采樣以及犢牛日齡偏小有關(guān)。國內(nèi)外關(guān)于該病原的流行病學(xué)資料較多，雖然其在BRD發(fā)病機(jī)制中是原發(fā)性致病原還是機(jī)會性病原一直存在爭議，但從檢測到病原的犢牛群發(fā)現(xiàn)中耳炎、關(guān)節(jié)炎或肺炎癥狀可能會證實(shí)該病原的致病性。由于在環(huán)境中生存期有限，其主要通過直接接觸被感染牛只或通過生殖道傳播。對于飲奶犢牛還可通過攝入受污染的牛奶而感染，但多數(shù)養(yǎng)殖場的感染被認(rèn)為主要通過接觸鼻液傳播，并且有證據(jù)表明應(yīng)激或運(yùn)輸會增加鼻分泌物中的脫落。在本次檢測的10份其他樣品中(牛舍墊料、糞水、飲用乳液、水槽飲用水、料槽飼草混合物)，有一份料槽飼草混合物中檢測到，同時(shí)第3批次鼻拭子樣品中沒有檢測到該病原，說明該牧場的流行可能主要不是通過母源垂直傳播，而是由后期接觸傳播導(dǎo)致。在本次病料檢測中、和檢出率的逐次降低可能與牧場加強(qiáng)完善疾病防控體系有關(guān)。

有相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，引起B(yǎng)RD的病原體之間存在協(xié)同關(guān)系：和、和、BVDV和、BVDV和BRSV、BoHV-1 和BVDV、BRSV 和。因?yàn)榇嬖诓煌膮f(xié)同關(guān)系，犢牛感染一種病原和不同病原的多重感染組合以及各病原體參與組織損傷的時(shí)間前后順序不同，加大了根據(jù)病原對呼吸道疾病進(jìn)行簡單分類的難度，給牧場防控BRD帶來極大挑戰(zhàn)。本次綜合鼻拭子檢測結(jié)果顯示，該5種呼吸道常見菌的單一感染率為36.00%，牛群混合感染率為40.00%，其中以和雙重感染率最高達(dá)18.67%，且該兩種菌與、呈四重感染檢出率為2.67%，說明該牧場病原菌混合感染較嚴(yán)重。雖鼻腔棉拭子采樣比支氣管肺泡灌洗液、器官穿刺呼吸術(shù)的準(zhǔn)確性較低，但易操作、快速且應(yīng)激小，更適用于群體診斷。本次采集的75份患BRD犢牛的鼻拭子樣本中有18份樣品未檢出任何病原菌，可能說明該牧場還存在其他病原。因此，結(jié)合臨床癥狀和群體流行病史，聯(lián)合使用血清學(xué)檢測等技術(shù)，從不同生物學(xué)角度調(diào)查牛群感染狀態(tài)，同時(shí)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測，有助于牧場采取合適的防控方案。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在2019—2020年對四川省一規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的75份有BRD牛的鼻腔棉拭子和10份其他樣本進(jìn)行、、、、病原檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種常見BRD致病菌均有檢出，說明該牧場感染病原種類較復(fù)雜，還可能存在其他牛呼吸道病原體。的高檢出率表明其在我國BRD中的作用值得進(jìn)一步研究。