鄧哲宇，王乙婷，王穎潔，胡 菜，吳宇慧，趙宗儀，左其生，張亞妮

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類非編碼、由具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈前體RNA(precusor miRNA，pre-miRNA)經(jīng)核酸酶Dicer剪切產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈小RNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)在生物研究中的大量應(yīng)用，眾多的miRNA被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控精子的發(fā)生過程。研究表明，miR-124a與Scp3作用，通過與粗線期精母細(xì)胞或精子細(xì)胞的H1t/GC-box 結(jié)合，進(jìn)而激活 H1t 組蛋白啟動(dòng)子；miR-29b通過與Dnmt3a、Dnmt3b作用調(diào)控PGC向雌性生殖細(xì)胞分化；miR-18通過下調(diào)熱休克蛋白2(HSP2)的表達(dá)而在小鼠精子發(fā)生過程中起到一定的調(diào)控作用；miR-34c通過靶向作用2以促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞的分化；眾多研究結(jié)果提示，miRNA在雄性生殖細(xì)胞的分化中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)前期研究表明，miR-31可與8基因的3’端非編碼區(qū)域(3-untranslated region，3′UTR)結(jié)合而抑制8表達(dá)，調(diào)控減數(shù)分裂的發(fā)生。

目前關(guān)于miR-31的研究大部分是集中于癌癥方面：miR-31過表達(dá)會(huì)使人肺腺癌細(xì)胞周期阻滯在S期；miR-31通過抑制eNOS表達(dá)參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙發(fā)生發(fā)展過程；miR-31通過下調(diào)結(jié)直腸癌中抑癌基因-1的表達(dá)從而增加轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a的活性，最終間接上調(diào)HIF-1a所調(diào)控的下游腫瘤相關(guān)癌基因的表達(dá)。而關(guān)于調(diào)控其表達(dá)的機(jī)制尚未明確，僅唐燚等發(fā)現(xiàn)在小鼠肌原細(xì)胞系C2C12細(xì)胞中過量添加維甲酸可以促進(jìn)miR-31-5p的表達(dá)。

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件，其活性的高低直接影響著蛋白的表達(dá)水平。根據(jù)啟動(dòng)基因表達(dá)方式的不同，啟動(dòng)子可以分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型啟動(dòng)子三大類，它們通過不同的方式在基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。目前，已有不少的啟動(dòng)子被克隆，用于表達(dá)載體的構(gòu)建。研究啟動(dòng)子功能應(yīng)用比較廣泛的方法是構(gòu)建5′側(cè)翼區(qū)或3′側(cè)翼區(qū)部分片段的報(bào)告基因表達(dá)載體，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法分析報(bào)告基因表達(dá)的情況來獲得該片段是否具備啟動(dòng)子的功能及其轉(zhuǎn)錄活性的強(qiáng)弱。

鑒于此，本研究克隆了如皋黃雞gga-miR-31-5p啟動(dòng)子5′側(cè)翼區(qū)2 180 bp片段的啟動(dòng)子序列，置換pEGFP-N1的CMV啟動(dòng)子構(gòu)建其pEGFP重組載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，初步確定gga-miR-31-5p啟動(dòng)子活性區(qū)域，同時(shí)利用在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期弄清機(jī)體內(nèi)gga-miR-31-5p的轉(zhuǎn)錄影響因素，為后續(xù)進(jìn)一步研究精子發(fā)生提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 種蛋、細(xì)胞和質(zhì)粒

新鮮受精蛋來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所；雞胚胎成纖維細(xì)胞系(DF-1)、pEGFP-N1、pEGFP-Linker為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

PrimeSTARMax DNA Polymerase、6×loading Buffer和DL 5000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物公司TaKaRa；限制性內(nèi)切酶Ⅰ/dⅢ購(gòu)自Bio-lab；通用型DNA純化回收試劑盒(DP214)和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP118)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×SoSoo連接酶、瓊脂糖和大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司； FuGENEHD(E2311)購(gòu)自Promega公司；Opti、胎牛血清、胰酶購(gòu)自Gibco；Corning DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自康寧公司；引物合成及測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.3 儀器

PCR儀、濃度測(cè)定儀器、離心機(jī)、熒光酶標(biāo)儀、CO培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo；電泳系統(tǒng)購(gòu)自北京六一公司；熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad； SW-CJ醫(yī)用型超凈臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus；正置熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon；數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；孵化箱購(gòu)自德州市德城區(qū)瑞泰孵化設(shè)備研制中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)與生物學(xué)分析

利用UCSC(http://genome.ucsc.edu/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene/)對(duì)gga-miR-31-5p的premiRNA(GeneID：NR_031499.1)上游區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，選取上游2 180 bp序列，利用在線預(yù)測(cè)軟件Promoter 2.0 Prediction Server(http://www.cbs.dtu.dk/servic-es/Promoter/)、PROMO HOME PAGE(http://alg gen.lsi. upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB=TF_8.3) 和AliBaba 2.1(http://gene-regulation.com/pub/prog rams/alibaba2/in dex.html)對(duì)gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)及其潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1.2.2 pEGFP-miR-31-promoter重組質(zhì)粒的構(gòu)建與定性分析

基因組DNA的提取和gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)克隆。參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，采用常規(guī)的苯酚抽提法提取基因組DNA。利用UCSC和NCBI尋找gga-miR-31-5p的premiRNA上游區(qū)域序列。利用NEBuilder(https://nebuilderv1.neb.com/？tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg)設(shè)計(jì)pEGFP-miR-31-promoter重組質(zhì)粒同源重組引物F1/R1：F1:5′-taccgccatgcattagttattaatCCTGCAAGGTCACAGTGAAAC-3′，R1:5′-ccgtcgactgcagaattcgaagcttCTTGTTAGAAAGCCATCTG-3′(引物序列中小寫字母為pEGFP-N1ⅠdⅢ兩側(cè)同源臂，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度2 229 bp)。以18.5 d胚齡如皋黃雞睪丸基因組DNA為模板，通過PrimeSTARMax DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)域，反應(yīng)體系：PrimeSTARMax DNA Polymerase 10 μL，F(xiàn)1 (10 μmol·L) 1 μL，R1(10 μmol·L) 1 μL，基因組1 μL ，ddHO 7 μL。反應(yīng)程序: 98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，紫外燈下切下目的片段，并使用天根DNA純化回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收，命名為miR-31-2180。

pEGFP-N1質(zhì)粒酶切。利用限制性內(nèi)切酶ⅠdⅢ對(duì)pEGFP-N1載體進(jìn)行線性化并去除其CMV啟動(dòng)子，反應(yīng)體系為：Ⅰ 1 μL，dⅢ 1 μL，10×Cutsmart Buffer 5 μL，質(zhì)粒 1 μg，ddHO補(bǔ)足至50 μL，37 ℃水浴15 min，線性化的載體經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下切下目的片段，并使用天根DNA純化回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收，命名為AH-pEGFP，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

pEGFP-miR-31-promoter重組質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化。利用同源重組酶將回收的PCR產(chǎn)物(gga-miR-31-5p啟動(dòng)子)與線性化的AH-pEGFP連接，反應(yīng)體系為：2×SooSo Mix 5 μL，AH-pEGFP 3μL，miR-31-2180 2 μL。樣品充分混合后，置于PCR儀中，50 ℃ 運(yùn)行15 min。將連接產(chǎn)物10 μL加入至50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴5 min，42 ℃水浴熱激45 s，迅速置于冰中2 min，之后加入無抗生素LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃ 180 r·min搖床中1 h，瞬離濃縮菌液，棄上清800 μL，剩余菌液吹打均勻后取100 μL，利用無菌三角棒涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)10～16 h。待LB固體培養(yǎng)基中長(zhǎng)出單菌落后，利用滅菌后的白槍頭挑取單菌落置于1 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r·min搖床中搖菌8～12 h。

pEGFP-miR-31-promoter重組質(zhì)粒鑒定。利用pEGFP-N1的通用引物對(duì)上述獲得的菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定(N1F: 5′-acttgagcgtcgatttttgtgatgct-3′，N1R: 5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3′，通用引物為pEGFP-N1酶切位點(diǎn)ⅠdⅢ兩側(cè)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物含有啟動(dòng)子片段，大小應(yīng)為153 bp+插入片段+99 bp，pEGFP-N1進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物大小為911 bp)。反應(yīng)體系：PrimeSTARMax DNA Polymerase 10 μL，N1F (10 μmol·L) 1 μL，N1R (10 μmol·L) 1 μL，菌液1 μL，ddHO 7 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后向PCR 產(chǎn)物中加入6× loading buffer 混勻后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，鑒定陽(yáng)性菌液送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序陽(yáng)性的菌液命名為pEGFP-miR-31-2180。

質(zhì)粒DNA的提取。將pEGFP-miR-31-2180或pEGFP-N1載體按照1∶1 000的比例接種到7 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min，搖床培養(yǎng)12～14 h，待菌液渾濁呈發(fā)白狀態(tài)是(值約為0.6)離心收集菌體。超凈臺(tái)保種2管，各1 mL。參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行質(zhì)粒提取。

pEGFP-miR-31啟動(dòng)活性定性分析。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DF-1細(xì)胞接種于24孔板，每孔約1.5×10個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁，匯合度達(dá)60%左右時(shí)，參照Fugene使用說明書，∶=3∶1，每孔500 ng質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pEGFP-miR-31-2180轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組(pEGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(pEGFP-Linker)，轉(zhuǎn)染48 h 后于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。利用UCSC(http://genome.ucsc.edu/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)對(duì)gga-miR-31-5p的premiRNA(GeneID：NR_031499.1)上游區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用在線預(yù)測(cè)軟件Promoter 2.0 Prediction Server(http://www.cbs.dtu.dk/servic-es/Promoter/)、PROMO HOME PAGE(http://alg gen.lsi. upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/prom oinit.cgi？dirDB=TF_8.3) 和AliBaba 2.1(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/in dex.html)對(duì)gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)系列片段PCR擴(kuò)增

為分析調(diào)控gga-miR-31-5p轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，以18.5 d如皋黃雞睪丸組織所提取全基因組DNA為模板，擴(kuò)增出pre-miR-31上游2 180 bp片段，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，所獲得的gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)的PCR產(chǎn)物在2 000 bp marker附近存在特異性條帶，大小與預(yù)期相符(圖1)，表明初步成功獲得目的DNA片段。

M，DL5000 Marker；1，pEGFP-miR31-2180.圖1 gga-miR-31-5p啟動(dòng)子片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of gga-miR-31-5p promoter fragment

2.2 雞pEGFP-miR-31-promoter重組載體構(gòu)建

利用同源重組技術(shù)將該片段連接至切除CMV啟動(dòng)子的pEGFP-N1載體中，經(jīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和挑菌擴(kuò)搖后，利用pEGFP-N1通用引物N1F和N1R對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，并以pEGFP-N1載體作為對(duì)照(911 bp)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在2 000～3 000 bp區(qū)域獲得相應(yīng)片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)；測(cè)序結(jié)果表明，miR31-2180重組載體構(gòu)建成功(圖3)；并將其命名為pEGFP-miR-31-2180。

M， DL5000 Marker；N， pEGFP-N1；1 and 2， pEGFP-miR31-2180.圖2 gga-miR-31-5p啟動(dòng)子系列載體菌液PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of gga-miR-31-5p promoter

圖3 pEGFP-miR-31-2180載體測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of pEGFP-miR-31-2180 vectors

2.3 雞gga-miR-31-5p啟動(dòng)子活性的定性分析

為檢測(cè)片段-2 180～+1 bp 是否具有啟動(dòng)子活性，將pEGFP-miR31-2180、pEGFP-N1和pEGFP-Linker分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞。結(jié)果表明，經(jīng)pEGFP-miR31-2180轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞表達(dá)GFP(圖4)，但其熒光強(qiáng)度弱于CMV驅(qū)動(dòng)的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N1(圖4)，而缺失CMV的陰性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-Linker在細(xì)胞中未檢測(cè)到GFP的表達(dá)(圖4)。 因此，-2180～+1 bp片段具有啟動(dòng)子活性。

2.4 gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)核心元件預(yù)測(cè)

利用AliBaba 2.1(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分別對(duì)-2180～+1 bp區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)(表1)，發(fā)現(xiàn)gga-miR-31-5p的啟動(dòng)區(qū)域含有AP-1、ATF、GR、RARα、c-Jun、HNF-4a、REV-ErbA、ER和HNF-1等結(jié)合位點(diǎn)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(表2)。由于在其啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到了RARa轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步說明gga-miR-31-5p的轉(zhuǎn)錄極有可能受到RA調(diào)控。

圖4 雞gga-miR-31-5p啟動(dòng)子-2 180～+1 bp片段的活性檢測(cè)Fig.4 Activity detection of gga-mir-31-5p promoter -2 180-+1 bp in chicken

表1 gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

3 討論

miRNA的正確轉(zhuǎn)錄由復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子與miRNAs前體(pre-miRNAs)啟動(dòng)子區(qū)的相互作用是其重要的組成部分。外界環(huán)境的各種刺激或不同發(fā)育階段的各種信號(hào)會(huì)促使不同的轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合，激活或抑制miRNAs的轉(zhuǎn)錄，影響到成熟miRNAs的表達(dá)水平及其生物學(xué)功能，繼而影響miRNA在機(jī)體發(fā)育中的作用。彭耀中等發(fā)現(xiàn)，1基因可能通過調(diào)節(jié)miRNA-148b-3p 啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平而影響腫瘤細(xì)胞的增殖；劉海亭等發(fā)現(xiàn)，早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子(EGRl)可抑制miR-616的表達(dá)而上調(diào)CDC34的表達(dá)；吳大鵬等發(fā)現(xiàn)，X-inactivation gene(XIST)通過結(jié)合于miR-193a-3p的啟動(dòng)子區(qū)而調(diào)節(jié)阻抑剪切因子(Rsf-1)的表達(dá)，從而影響骨肉瘤的進(jìn)展；陳誠(chéng)等發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) TEAD1 可顯著提升 miR-182 的表達(dá)而參與調(diào)控參與黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；Jiang等通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-378的啟動(dòng)子區(qū)域在其上游-698～-94 bp處含有SREBP和C/EBP結(jié)合位點(diǎn)；肌肉組織形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SRF和MyoD可調(diào)控心肌特異性表達(dá)的miR-1調(diào)節(jié)；Yin等發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞中的類固醇因子-1(SF-1)能與miR-383的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而促進(jìn)miR-383的表達(dá)；Janga等發(fā)現(xiàn)，miR-32位于其宿主基因跨膜蛋白245(transmenmbrance protein 245，TMEm245)的第14個(gè)內(nèi)含子中，與其宿主基因共表達(dá)；且他們產(chǎn)生在內(nèi)含子剪接之前，這些miRNAs和它的宿主基因mRNA來自于相同轉(zhuǎn)錄本，所以，調(diào)控這些miRNAs和它們相應(yīng)的宿主基因表達(dá)應(yīng)是相同機(jī)制。

本研究將如皋黃雞gga-miR-31-5p前體RNA 5′側(cè)翼區(qū)-2 180～+1 bp片段作為gga-miR-31-5p啟動(dòng)子片段進(jìn)行啟動(dòng)子活性定性分析。以DF-1細(xì)胞為轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，F(xiàn)ugene介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)pEGFP-miR31-2180轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞表達(dá)GFP，但其熒光強(qiáng)度較陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N1弱，而缺失CMV啟動(dòng)子的陰性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-Linker在細(xì)胞中則未檢測(cè)到GFP的表達(dá)。說明如皋黃雞的gga-miR-31-5p前體RNA 5′側(cè)翼區(qū)-2 180～+1 bp片段是具備其啟動(dòng)子活性的，但其啟動(dòng)活性及效率上不及作為陽(yáng)性對(duì)照的CMV啟動(dòng)子。

為了深入了解gga-miR-31-5p的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步根據(jù)雞gga-miR-31-5p啟動(dòng)子序列及其啟動(dòng)子活性定性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)如皋黃雞gga-miR-31-5p 前體5′側(cè)翼區(qū)2 180 bp片段序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該區(qū)域存在C/EBP alpha、c-Jun、GR、HNF-4α、HNF-1、HOXA4、ICSBP、IRF1、REV-ErbA、RAP1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子在不同細(xì)胞中存在差異表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子是否是引起gga-miR-31-5p表達(dá)差異的關(guān)鍵因子需要進(jìn)一步的探究；前期研究亦表明，轉(zhuǎn)錄因子c-jun在有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變過程中具有潛在的調(diào)控作用，Hoxa4則是在早期減數(shù)分裂表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用是否經(jīng)由gga-miR31-5p-stra8信號(hào)鏈起作用尚不清楚。gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)域同樣含有ER受體結(jié)合位點(diǎn)，研究表明，ERα基因敲除雄性小鼠缺乏雄激素轉(zhuǎn)換為雌激素的芳香化酶，引起生殖缺陷和生殖細(xì)胞減少；在哺乳動(dòng)物中ERβ亞型在睪丸所有生殖細(xì)胞中表達(dá)。因此，在生精過程中存在ERβ調(diào)控pre-miR-31的轉(zhuǎn)錄，通過影響gga-miR-31-5p-stra8信號(hào)，從而影響精子形成的可能。

4 結(jié)論

采用PCR方法成功克隆了如皋黃雞的gga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)-2 180～+1 bp，成功構(gòu)建了pEGFP-miR31-2 180重組載體，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)-2 180～+1 bp具有啟動(dòng)子活性，進(jìn)一步確定該區(qū)域?yàn)間ga-miR-31-5p啟動(dòng)子區(qū)；并發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子區(qū)存在C-jun、RARα和ER等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。