樊有存，張紅巖，楊旭升，韓 芊，劉玉皎，武學(xué)霞，*

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810000； 2.青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧810000)

土壤鹽漬化嚴(yán)重制約著植物的生長發(fā)育和作物產(chǎn)量，我國約20%的耕地面積受到土壤鹽漬化的影響。蠶豆(L.) 作為我國重要的食用豆類作物之一，其生長也易受到鹽脅迫制約。蠶豆鮮草營養(yǎng)元素豐富，作為綠肥還田后能使得土壤有機質(zhì)含量、全氮含量、水解氮、速效磷及速效鉀的含量明顯升高，并能很好地中和土壤堿性。將蠶豆根系分泌物添加到堿性土壤，能有效降低土壤堿解氮含量和pH值，而土壤有效磷、鐵、鋅及速效鉀含量和微生物數(shù)量均顯著增加。蠶豆可以種植在全鹽含量小于0.5%的沿海鹽堿土壤中，其生育中后期的抗鹽堿性可能強于豌豆。綜上所述，蠶豆可作為良好的耐鹽作物進行育種，而解析蠶豆離子調(diào)控等耐鹽基因功能為培育耐鹽蠶豆新品種提供重要的理論基礎(chǔ)。

鹽脅迫對植物的影響主要通過滲透脅迫和離子毒害產(chǎn)生，而Na導(dǎo)致的離子毒害和鹽脅迫引發(fā)的植物對K的吸收匱乏也是重要原因。植物主要通過各類質(zhì)膜上的離子泵、共轉(zhuǎn)運體和離子通道與環(huán)境進行離子交換，其中高親和性K轉(zhuǎn)運蛋白—HKT(high affinity Ktransporter)轉(zhuǎn)運蛋白是一類與植物耐鹽性相關(guān)的Na與K轉(zhuǎn)運蛋白或Na/K共轉(zhuǎn)運體。植物HKT家族主要包含兩個亞家族，即亞家族Ⅰ和亞家族Ⅱ。亞家族Ⅰ廣泛分布于雙子葉植物中，具有 Na轉(zhuǎn)運特性；亞家族Ⅱ主要分布于單子葉植物中，具有Na/K協(xié)同轉(zhuǎn)運活性。近年來，研究人員在多種植物中均克隆獲得了HKT家族成員基因，其中也不乏豆科植物。大豆中共發(fā)現(xiàn)4個基因，均屬于第Ⅰ亞組。Chen 等從大豆中克隆獲得1;1，1;4等基因，1;1表達量在經(jīng)150 mmol·LNaCI處理的大豆根與葉中顯著上升，而1;4在NaHCO及NaCl脅迫下的大豆根部組織中表達量顯著上升；將1;1過表達至煙草中，能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，而將1;4轉(zhuǎn)化至煙草后，煙草具有良好的抗NaHCO及NaCl的生長表型，且植株內(nèi)積累了較多的K，而Na含量則較少。

在蠶豆中，關(guān)于耐鹽功能基因HKT 家族基因的序列及功能解析尚未有報道。本研究依據(jù)本課題組前期的蠶豆耐鹽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出標(biāo)注為6的Unigene，以鹽脅迫下的蠶豆葉片為材料，擴增獲得蠶豆HKT家族成員基因1;1，并且對其進行生物信息學(xué)分析和基因表達特性分析。本研究有助于解析蠶豆HKT家族基因在耐鹽離子調(diào)控中的功能，也為蠶豆耐育種工作提供候選基因與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所用材料由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院提供。將篩選獲得耐鹽性能優(yōu)良的蠶豆種質(zhì)2013-04種子，用 5% NaClO消毒處理，置于植物光照培養(yǎng)箱黑暗萌發(fā)10 d后選擇長勢一致的幼苗，移至裝有石英砂的塑料盆中并置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃ 光照/18 ℃ 黑暗，相對濕度 70%±5%，光周期 16 h光照/8 h黑暗，光量子通量密度(PPFD) 250 μmol·m·s，待完全長出真葉后，分別用 0、50、100、150 mmol·LNaCl溶液于每天同一時間對蠶豆幼苗進行灌溉處理，并記錄生長狀況。用于熒光定量的實驗材料用以上濃度的NaCl溶液每隔2、4、8、12、24 h進行處理，然后分別取蠶豆幼苗葉片與根部于液氮速凍，后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

主要試劑：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，PrimeSTARMax DNA Polymerase高保真擴增酶、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒(TaKaRa)，載體pTOPO (北京艾德萊生物科技有限公司)。主要儀器設(shè)備有：梯度PCR儀(VeritiSimpliAmpProFlex 96，ABI)，低溫高速離心機(Centrifuge 5430 R，Eppendorf )，超微量核酸蛋白測定儀(Implen NP80 Mobile，Implen)，實時熒光定量PCR儀(LightCycler480，Roche)等。

1.3 RNA提取及cDNA合成

取蠶豆組織50～100 mg，按照試劑盒說明書進行總RNA提取。使用超微量核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度及純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。選用質(zhì)量合格的總RNA進行cDNA反轉(zhuǎn)錄合成，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因擴增

以轉(zhuǎn)錄組注釋的6的Unigene為模板，采用Prime Primier 5.0設(shè)計基因擴增引物VfHKTF：5′-AATATCTTAAATTCTTTTTTG-3′和VfHKT R：5′-CTAGAGAAGTTTCCATGGCT-3′，引物由天津金唯智生物科技有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用PrimeSTARMax DNA Polymerase高保真擴增酶進行目的基因擴增。將擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化后連接至pTOPO載體上，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α中，挑取單克隆進行菌液PCR驗證，陽性克隆進行測序。

1.5 序列分析及HKT蛋白生理特性分析

開放閱讀框ORF預(yù)測：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/；蛋白比對：Blast在線軟件https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；進化樹分析：MEGA 5.0；蛋白的氨基酸組成：ExPasy-Protparam在線軟件https://web.expasy.org/protparam/；信號肽預(yù)測：SignalP-5.0在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測：TMHMM Server v.2.0在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/；蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析：CDD在線軟件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；蛋白二級結(jié)構(gòu)：SOPMA 在線軟件https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html；蛋白三級結(jié)構(gòu)：SWISS-MODEL在線軟件 https://swissmodel.expasy.org/。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

實驗選用蠶豆1基因為內(nèi)參基因(表1)，用NCBI Primer-BLAST在線軟件設(shè)計了4對用于檢測1;1基因的qRT-PCR引物(表1)，其中引物HKT1-889F與HKT1-1069R擴增效率高，條帶單一，且熔解曲線顯示單一信號峰，被用于后續(xù)實驗。利用實時熒光定量PCR儀LightCycler480，采用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒進行qRT-PCR分析。程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃，1 min，進行熔解曲線分析；50 ℃降溫30 s，實驗設(shè)定3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆材料培養(yǎng)

將黑暗條件下萌發(fā)7 d的蠶豆幼苗移至盛有石英砂的花盆中，用不同濃度的NaCl溶液于每天同一時間對幼苗進行定量灌溉處理，結(jié)果顯示，鹽脅迫嚴(yán)重影響蠶豆植株的生長，且處理時間越長，鹽濃度越高，植株生長受損越明顯(圖1)。本課題組前期的蠶豆抗鹽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果表明，在100 mmol·L的NaCl溶液處理7 d的蠶豆幼苗根部中能明顯檢測到蠶豆HKT成員基因表達，說明蠶豆HKT成員基因表達可能受鹽脅迫誘導(dǎo)，所以本實驗收集了100 mmol·LNaCl處理7 d后的蠶豆幼苗根部用于總RNA提取及基因克隆。

2.2 目的基因的擴增

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋的6基因的Unigene，設(shè)計引物VfHKT-F與VfHKT-R。以鹽脅迫處理的蠶豆幼苗根部為材料提取總RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，擴增獲得一段長度為2 024 bp的序列(圖2-A)，將該序列連接到pTOPO載體上，挑取陽性克隆進行測序(圖2-B)。將測序獲得序列進行開放閱讀框ORF預(yù)測，結(jié)果顯示，該片段包含一個完整的ORF，該完整ORF長度為1 659 bp，包含 552個氨基酸(圖3)。該基因序列信息已經(jīng)提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，序列編號為MT740279.1。將該蛋白序列用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast在線軟件進行比對，確定該蛋白是HKT蛋白，且暫時命名為VfHKT1。

表1 qRT-PCR引物序列

A，不同濃度鹽處理下的株高(標(biāo)尺=3 cm)；B，不同濃度鹽處理下的葉片表型(標(biāo)尺=2 cm)。A，Plant height of faba bean under different NaCl concentrations(bar=3 cm)；B，Leaf area of faba bean under different NaCl concentrations(bar=2 cm).圖1 不同濃度NaCl處理7 d后的蠶豆幼苗Fig.1 Seedlings of faba bean irrigated with different concentration of NaCl for 7 days

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 植物VfHKT1;1蛋白進化樹構(gòu)建與分析

高親和性K轉(zhuǎn)運蛋白(HKT)是普遍分布于植物、細(xì)菌及真菌中的一類離子通道。為了比較蠶豆VfHKT1蛋白與其他植物中該蛋白的親緣關(guān)系，使用MEGA 5.0進行進化分析。進化樹分析表明VfHKT1蛋白屬于HKT第Ⅰ亞家族(圖4)，按照Plantten等和Hauser等對HKT家族的命名規(guī)則，將該基因命名為VfHKT1;1，其中分號前面的數(shù)字代表該基因?qū)儆诘冖駚喖易?，分號后面的?shù)字代表發(fā)現(xiàn)的順序編號。進化樹結(jié)果顯示，蠶豆VfHKT1;1與蒺藜苜蓿()MtHKT1;1的進化關(guān)系較近(圖4)。

2.3.2 VfHKT1;1氨基酸組成

蛋白的氨基酸組成根據(jù)其功能往往具有特異性，ExPasy-Protparam軟件分析結(jié)果表明，VfHKT1;1蛋白相對分子質(zhì)量為62.7 ku，理論等電點為9.26，其氨基酸組成如表2所示，其中亮氨酸含量最多(80，14.5%)，其次為絲氨酸(54，9.8%)、異亮氨酸(46，8.3%)、賴氨酸(42，7.6%)、苯丙氨酸和纈氨酸(38，6.9%)。帶負(fù)電荷殘基數(shù)為(天冬氨酸+谷氨酸)37，帶正電荷殘基數(shù)為(精氨酸+賴氨酸)55。不穩(wěn)定指數(shù)為31.17(<40)，說明該蛋白較為穩(wěn)定。

A，VfHKT1基因擴增；B，VfHKT1基因陽性克隆菌落鑒定。1、2、3和4均為PCR產(chǎn)物。A，Cloning of VfHKT1 gene；B，Identification of positive colonies of VfHKT1 gene. 1， 2， 3 and 4 represented PCR products.圖2 VfHKT1基因擴增及鑒定Fig.2 Cloning of VfHKT1 gene and identification of the positive clone

圖3 VfHKT1氨基酸序列Fig.3 Amino acid sequence of VfHKT1

星號標(biāo)記的為蠶豆VfHKT1;1 蛋白。Asterisk indicated the VfHKT1;1 of faba bean.圖4 VfHKT1;1與其他高等植物HKT蛋白的進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of VfHKT1;1 with other HKT transporters from higher plants

表2 VfHKT1;1蛋白氨基酸組成

2.3.3 VfHKT1;1蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)分析

信號肽是決定分泌蛋白分選途徑的重要決定因子，所以是蛋白功能的重要組成部分。SignalP-5.0軟件分析結(jié)果顯示，VfHKT1;1蛋白具有信號肽的概率為0.001 5(圖5)，說明其不具有信號肽且不屬于分泌蛋白。通過TMHMM Server v.2.0 在線軟件對VfHKT1;1的跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白具有8個跨膜區(qū)域(圖6)，說明該蛋白屬于跨膜蛋白。采用CDD在線軟件分析該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有HKT家族典型的保守結(jié)構(gòu)域TrKH(圖7)，由此推測VfHKT1;1是位于膜結(jié)構(gòu)的離子轉(zhuǎn)運蛋白。

2.3.4 VfHKT1;1蛋白結(jié)構(gòu)分析

蛋白的功能和活性很大程度上取決于蛋白結(jié)構(gòu)。利用SOPMA 在線軟件分析VfHKT1;1 的二級結(jié)構(gòu)(圖8)，結(jié)果顯示，該蛋白主要由α-螺旋(45.11%)、無規(guī)則卷曲(31.16%)、延伸鏈(16.67%)和β-轉(zhuǎn)角(7.07%)組成。隨后又使用SWISS-MODEL在線軟件模擬該蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖9)，結(jié)果顯示，該蛋白三級結(jié)構(gòu)功能與鉀離子轉(zhuǎn)運體功能一致。

2.3.51;1基因表達特性分析

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，正常生長情況下1;1基因能在蠶豆葉片與根部表達，但在根中的表達水平明顯較高(圖10-A)，說明1;1基因的表達具有明顯的組織特異性。使用100 mmol·LNaCl溶液對蠶豆幼苗進行處理，鹽脅迫能明顯誘導(dǎo)蠶豆葉片中1;1基因的表達，且1;1基因在鹽脅迫1 h后表達明顯上調(diào)，隨后隨著處理時間的延長，其表達量逐漸下調(diào)(圖10-B)。而在根中1;1基因的表達受到鹽脅迫抑制，且該基因表達量隨著鹽脅迫時間延長而降低(圖10-C)。

圖5 VfHKT1;1信號肽預(yù)測Fig.5 Signal peptide prediction for VfHKT1;1

圖6 VfHKT1;1跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Transmembrane domain prediction of VfHKT1;1

圖7 VfHKT1;1保守結(jié)構(gòu)域(CDD)分析Fig.7 CDD analysis of VfHKT1;1

圖8 VfHKT1;1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 The secondary structure prediction of VfHKT1;1

圖9 VfHKT1;1三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Three-dimensional structure predictions of VfHKT1;1

A，正常生長條件下VfHKT1;1基因在蠶豆根與葉片中的表達水平；B，NaCl處理下VfHKT1;1基因在蠶豆葉片中的表達水平；C，NaCl處理下VfHKT1;1基因在蠶豆根中的表達水平。圖中所顯示數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，*，**分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。A，The expression of VfHKT1;1 gene in faba bean root and leaf under normal conditions；B，The expression of VfHKT1;1 gene in faba bean leaf under NaCl stress；C，The expression of VfHKT1;1 gene in faba bean root under NaCl stress. Values were means±SD (n=3). *，** represented significant differences at P<0.05 and P<0.01，respectively.圖10 蠶豆VfHKT1;1基因表達分析Fig.10 Relative expression level of VfHKT1;1 gene in faba bean

3 討論

植物高親和性K轉(zhuǎn)運蛋白(high affinity Ktransporter， HKT)介導(dǎo)的Na轉(zhuǎn)運及Na/K協(xié)同轉(zhuǎn)運過程不僅是植物響應(yīng)鹽脅迫的重要機制，而且對維持植物內(nèi)的Na/K平衡起著重要作用。HKT第Ⅰ亞家族分布于高等植物尤其是雙子葉植物中，并且對Na的選擇性強于其他陽離子。本研究首次從蠶豆中擴增獲得一個高親和的K轉(zhuǎn)運載體，經(jīng)過進化樹分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贖KT第Ⅰ亞家族，因此命名為VfHKT1;1，且該蛋白序列與苜蓿MtHKT1;1高度同源，序列相似度高達87.54%。此前，研究人員也多次通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)蠶豆和蒺藜苜蓿的序列同源關(guān)系最近。生物信息學(xué)分析顯示，VfHKT1;1蛋白不屬于分泌蛋白，具有8個跨膜區(qū)域，這與植物HKT家族一般包含8個跨膜區(qū)域的典型特征相符，且HKT轉(zhuǎn)運蛋白包含有4個跨膜MPM基序(membrane-pore-membrane motif)，1個MPM結(jié)構(gòu)含有2個跨膜螺旋和1個P-loop環(huán)，因此VfHKT1;1屬于跨膜蛋白。此外，VfHKT1;1含有HKT家族典型的保守結(jié)構(gòu)域TrKH，其蛋白三級結(jié)構(gòu)與枯草芽孢桿菌鉀離子轉(zhuǎn)運體KtrAB結(jié)構(gòu)相近。以上結(jié)論表明，蠶豆VfHKT1;1是定位膜結(jié)構(gòu)上的陽離子轉(zhuǎn)運體，可能介導(dǎo)了蠶豆細(xì)胞內(nèi)Na/K離子的轉(zhuǎn)運。

不同植物HKT成員可能因承擔(dān)著不同的細(xì)胞及生理功能，呈現(xiàn)不同的表達模式。本研究測定得知，蠶豆1;1基因在根部與葉片組織均有表達，但在根部表達量明顯高于葉片組織，說明該基因在蠶豆植株內(nèi)具有表達多樣性。而關(guān)于1;1基因的表達多樣性在多種植物中均有報道，例如擬南芥1;1在根部及葉片維管束中表達；水稻1;3基因在葉、葉鞘及莖中表達；1;4在地上部維管束中表達；1;5在根部和葉鞘中表達。

鹽脅迫下，葉片中1;1基因在1h后表達量上調(diào)，可能是該基因參與了鹽離子在葉片組織中的轉(zhuǎn)運或卸載過程。而1;1基因在根部的表達量，隨著鹽脅迫時間的延長呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，這可能是因為該基因在根部參與了Na的轉(zhuǎn)運，主要表現(xiàn)為在鹽脅迫下表達下調(diào)以減少Na的攝入。因此，鹽脅迫條件下1;1基因在葉片中表達量上調(diào)，而在根部的表達量呈下調(diào)趨勢。當(dāng)然，對于1;1基因的具體功能及其響應(yīng)鹽脅迫的分子機制還需大量工作驗證，比如其組織定位、亞細(xì)胞定位、鹽脅迫下的細(xì)胞內(nèi)離子含量變化規(guī)律、轉(zhuǎn)基因植株功能驗證等等。本研究有助于解析蠶豆HKT家族基因在耐鹽離子調(diào)控中的功能，也為蠶豆耐鹽育種工作提供候選基因與理論基礎(chǔ)。