靳曉杰，張靜珍，2，楊新筍，*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，湖北 武漢 430064； 2.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

山藥(Turcz.)別名薯蕷，是薯蕷科薯蕷屬一年生或多年生藤本植物，其地下塊莖是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源食物之一。山藥除作為食物為人類提供能量和營(yíng)養(yǎng)，亦是一味傳統(tǒng)中藥材，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的功效；其零余子俗稱山藥豆，是山藥植株地上葉腋間的珠芽。有研究表明，零余子亦可用作食補(bǔ)，其藥用成份與山藥大致相同，藥用功效也與山藥大致相同。據(jù)《本草拾遺》記載，山藥零余子補(bǔ)虛損、強(qiáng)腰腳、益腎、食之不饑，且曬干后功效強(qiáng)于山藥。

山藥塊莖與其零余子中含有的初生代謝物和次生代謝物是決定其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的物質(zhì)基礎(chǔ)。山藥塊莖中含有多糖、尿囊素、薯蕷皂苷、黃酮、多酚等多種生物活性物質(zhì)，可用于預(yù)防和治療糖尿病、腎炎、癌癥等多種疾病。而山藥皮中含有較高的尿囊素、總黃酮和總多酚，以及其特有的菲類化合物，使其較山藥塊莖肉質(zhì)具有更強(qiáng)的抗腫瘤和抗炎活性。但這些研究主要以一種或幾種化合物的鑒定為研究目的，通量較低，對(duì)山藥皮和山藥零余子中代謝物的種類了解尚不全面。

代謝組學(xué)是通過(guò)大量小分子代謝物的定性、定量分析來(lái)研究生物體內(nèi)代謝物的種類、含量及其在內(nèi)外因素作用下的變化規(guī)律。臘貴曉等利用UPLC-QTOF技術(shù)對(duì)鐵棍山藥和太谷山藥的代謝成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)8種差異代謝物，其中3種已知代謝物為植酸、麥解甾醇和豆固醇。An等利用NMR技術(shù)分析了鐵棍山藥皮和肉的42種代謝成分，發(fā)現(xiàn)13種代謝成分在山藥皮和山藥肉中存在顯著差異。以上研究均以鐵棍山藥為研究材料，而其他特色山藥的代謝物含量由于山藥種類不同，其含量存在差異，特別是自然生長(zhǎng)的野生山藥及其零余子的代謝成分仍然缺少全面了解。

湖北省武穴市是佛手山藥的主產(chǎn)地，同時(shí)還有豐富的野生山藥資源，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民多有采食和出售野生山藥的習(xí)慣，但關(guān)于當(dāng)?shù)匾吧剿幍臓I(yíng)養(yǎng)特性和藥用特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用LC-MS/MS方法對(duì)湖北省武穴市的一份野生山藥及其零余子進(jìn)行代謝組檢測(cè)與分析，從而系統(tǒng)地研究武穴野生山藥及其零余子中各代謝產(chǎn)物的種類和相對(duì)含量，為更好地利用其營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分提供物質(zhì)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)所用野生山藥及其零余子采集于湖北省武穴市，為薯蕷類山藥。材料采集后迅速用無(wú)菌水沖洗擦干，立即放入液氮中進(jìn)行冷凍處理，隨后經(jīng)真空冷凍干燥后，對(duì)山藥塊莖進(jìn)行皮肉分離，最終獲得山藥肉(rhizome flesh， RF)、山藥皮(rhizome peel， RP)和零余子(bulbil， BA)3組樣品，每組樣品取3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 代謝樣提取

使用研磨儀(Schwingmühle Tissue Lyser II， Germany)將凍干樣品研磨至粉末狀(29Hz，50s)。稱取100 mg樣品粉末，與1mL體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液(預(yù)先加入0.1 mg·L阿昔洛韋作為內(nèi)標(biāo))混合，渦旋振蕩3次后于4℃放置10 h。隨后9 500×離心10 min，取上清通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾得最終制備樣，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2 LC-MS/MS檢測(cè)

采用LC-ESI-MS/MS系統(tǒng)(HPLC，Shim-packUFLC SHIMADZU CBM20A system，5500 Q TRAP)進(jìn)行檢測(cè)。參照Chen等的方法，使用逐步多離子監(jiān)控器增強(qiáng)的產(chǎn)物離子來(lái)構(gòu)建MS2T庫(kù)；使用飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)(HPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZUCBM20A系統(tǒng)，三重TOF 5600)獲得每個(gè)前體離子的準(zhǔn)確m/z；使用預(yù)定的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法(MRM)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量。在Analyst 1.5軟件中，使用預(yù)定的MRM算法，MRM的檢測(cè)窗口為90 s，目標(biāo)掃描時(shí)間為1.0 s。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行代謝產(chǎn)物的主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算OPLS-DA模型中各代謝物的VIP值(variable important in projection)。利用MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca)在線平臺(tái)進(jìn)行單變量分析和層次聚類分析(HCA)等。利用多元統(tǒng)計(jì)VIP≥1、單變量統(tǒng)計(jì)FDR≤0.05且差異倍數(shù)(fold change， FC)≥2或≤0.5篩選零余子與山藥肉間(BA/RF)，以及山藥皮與山藥肉間(RP/RF)的差異代謝物。使用在線軟件Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtoolsVenn)繪制韋恩圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果

利用LC-MS/MS在野生山藥的山藥肉、山藥皮和零余子中共檢測(cè)到385種代謝物，其中，山藥肉中檢測(cè)到374種代謝物，山藥皮中檢測(cè)到367種代謝物，零余子中檢測(cè)到381種代謝物，分別屬于氨基酸及其衍生物、黃酮類、脂質(zhì)、核苷酸及其衍生物等11類(圖1，表1)。共有355種代謝物在山藥肉、山藥皮和零余子中均檢測(cè)到。

2.2 代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析

PCA分析結(jié)果如圖2-A所示，PC1和PC2可解釋各代謝物64.3%的總變異，說(shuō)明該模型可以較好地將樣本劃分為山藥肉、山藥皮和零余子3組。聚類熱圖結(jié)果顯示，同一組織的樣品聚類成一組，且代謝物在不同樣品組間的相對(duì)含量有明顯差異。通過(guò)檢測(cè)到的代謝物可將山藥肉、山藥皮和零余子分為2大類，其中山藥肉與零余子聚為一大類，山藥皮為另一大類。這說(shuō)明大量的代謝物在山藥肉、山藥皮和零余子中的相對(duì)含量存在偏好性(圖2-B)。

BA，零余子；RP，山藥皮；RF，山藥肉。下同。BA，Bulbil;RP，Rhizome peel;RF，Rhizome flesh.The same as below.圖1 野生山藥中代謝物數(shù)量韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the metabolites in wild Chinese yam

表1 野生山藥中代謝物分類

采用OPLS-DA方法進(jìn)行有監(jiān)督的差別統(tǒng)計(jì)分析，其中，零余子/山藥肉組的RX=0.721、RY=0.999、Q=0.961，山藥皮/山藥肉組的RX=0.724、RY=1、Q=0.994，模型擬合效果較好，能夠很好地區(qū)分不同樣品組間代謝物的差異(圖3)。

2.3 差異代謝物篩選與分析

以VIP≥1、FDR≤0.05且|logFC|≥1為閾值，在零余子與山藥肉間共篩選到70種差異代謝物，在山藥皮與山藥肉間共篩選到81種差異代謝物，其中，有26種代謝物在山藥皮/山藥肉和零余子/山藥肉中均存在顯著差異(圖4)。

A，PCA得分圖；B，層次聚類熱圖。A， PCA score plot; B，Hierarchical clustering heatmap.圖2 野生山藥及其零余子中代謝物的PCA圖和聚類熱圖Fig.2 PCA plot and heatmap of metabolites in rhizome and bulbil of wild Chinese yam

A，BA/RF組；B，RP/RF組。A，BA/RF group; B， RP/RF group.圖3 兩個(gè)對(duì)比組的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot of two comparison groups

在零余子/山藥肉組中共篩選到70種差異代謝物，其中，43種代謝物表現(xiàn)為上調(diào)，即在零余子中相對(duì)含量較高，主要為黃酮類(18種)、核苷酸及其衍生物類(6種)、有機(jī)酸類(5種)和其他類(9種)；另外27種代謝物表現(xiàn)為下調(diào)，即在山藥肉中相對(duì)含量較高，主要為氨基酸及其衍生物類(9種)、有機(jī)酸類(5種)和其他類(6種)。所有的黃酮類、核苷酸及其衍生物類、脂質(zhì)類和維生素及其衍生物類差異代謝物均為上調(diào)；除哌啶酸外，其余氨基酸及其衍生物類差異代謝物均為下調(diào)(圖4-A)。在零余子/山藥肉組中差異最大的前20種代謝物中，除纈氨酸和甲硫氨酸下調(diào)外，其他18種代謝物均上調(diào)，且主要為黃酮類(10種)(表2)。

共81種代謝物在山藥皮/山藥肉組中達(dá)顯著差異水平。其中，46種代謝物表現(xiàn)為上調(diào)，即在山藥皮中相對(duì)含量較高，主要為黃酮類(12種)和其他類(13種)；35種代謝物下調(diào)，即在山藥肉中相對(duì)含量較高，主要為氨基酸類(16種)和其他類(7種)。除leucyl-tryptophan外，其余氨基酸及其衍生物類代謝物均表現(xiàn)為下調(diào)(圖4-B)。山藥皮/山藥肉中差異最大的前20種代謝物中，有16種代謝物在山藥皮中相對(duì)含量高于山藥肉中，僅精氨酸、糠酸、戊烯二酸和3-[ethyl(nitroso)amino]propanoic acid 4種代謝物在山藥肉中相對(duì)含量較高(表3)。

A，零余子/山藥肉；B，山藥皮/山藥肉。A，Bulbil/Rhizome flesh; B，Rhizome peel/Rhizome flesh.圖4 差異代謝物熱圖Fig.4 Heatmap of differentially accumulated metabolites

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)LC-MS/MS分析平臺(tái)對(duì)采自湖北省武穴市的野生山藥植株的山藥肉、山藥皮和零余子中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行廣靶代謝組學(xué)分析，共檢測(cè)到385種代謝物。檢測(cè)到的代謝物數(shù)量較之前研究大大增加，且多種代謝物為首次在山藥中被檢測(cè)到。這些將為全面了解山藥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值提供物質(zhì)依據(jù)。

表2 零余子和山藥肉中差異最大的前20種代謝物

表3 山藥皮和山藥肉中差異最大的前20種代謝物

山藥富含多種氨基酸。本研究將零余子與山藥肉中氨基酸相對(duì)含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，山藥肉中富含纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸4種人體必需氨基酸，以及丙氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸3種非必需氨基酸。特別是纈氨酸和甲硫氨酸在山藥肉中含量分別是零余子中含量的45.89倍和46.53倍。此外，山藥肉中還富含S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)即活性甲硫氨酸，它是人體內(nèi)最重要的甲基供體，參與生物體內(nèi)多個(gè)生化反應(yīng)。臨床研究表明，SAMe對(duì)慢性肝病、抑郁癥和骨關(guān)節(jié)炎等均具有較好的治療效果。An等利用NMR技術(shù)對(duì)鐵棍山藥的山藥皮和山藥肉進(jìn)行差異代謝分析發(fā)現(xiàn)，鐵棍山藥的山藥皮中富含蘇氨酸，山藥肉中富含亮氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸。本研究結(jié)果顯示，武穴野生山藥的山藥肉中精氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸的相對(duì)含量均顯著高于山藥皮中的相對(duì)含量，特別是精氨酸，其在山藥肉中的相對(duì)含量是山藥皮中的60.55倍。說(shuō)明武穴野生山藥的山藥肉中富含多種氨基酸及其衍生物，日常食用去皮山藥可為人們提供豐富的氨基酸類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

零余子因其體積小，被認(rèn)為商品價(jià)值不高，大部分被用作飼料或扔掉，而在功能成分方面研究較少，未能得到有效利用。本研究通過(guò)LC-MS/MS在武穴野生山藥的山藥肉和零余子中共檢測(cè)到54種黃酮類代謝物，其中，18種在零余子和山藥肉間存在顯著差異，且均表現(xiàn)為上調(diào)，即零余子中相對(duì)含量較高。異柚葡糖苷、C-hexosyl-chrysoeriol 5-O-hexoside、扁蓄苷、C-hexosyl-luteolin O-hexoside、金圣草素-6-C戊苷-8-C-己糖苷等10種黃酮類代謝物在零余子與山藥肉中相對(duì)含量差異較大。黃酮類化合物可清除自由基，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血壓、治療糖尿病等多種藥理作用。前人研究表明，多種薯蕷屬植物(spp.)含有黃酮類生物活性物質(zhì)，并且這些黃酮類物質(zhì)具有抗氧化活性。因此，上述黃酮類差異代謝物可使零余子較山藥肉具有更強(qiáng)的抗氧化功效。此外，零余子中還富含哌啶酸、維生素B、漆樹(shù)酸、芥子酸、蘋(píng)果酸、莽草酸等多種代謝物。這些差異代謝物將為零余子的營(yíng)養(yǎng)與藥用功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

在山藥加工工藝中均有去皮工序，產(chǎn)生的大量山藥皮作為廢料被丟棄，而不能合理有效利用。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，山藥皮中總黃酮含量高于山藥肉中含量。孟永海等通過(guò)比較生山藥、土炒山藥、麩炒山藥、蜜麩炒山藥去皮前后的總黃酮差異，證明山藥皮中含有大量的黃酮類物質(zhì)。但以上研究?jī)H比較了山藥皮和山藥肉中總黃酮含量的差異，對(duì)山藥皮和山藥肉中各種黃酮類物質(zhì)的含量仍缺少了解。本研究在山藥肉/山藥皮組中共鑒定到16種差異表達(dá)的黃酮類代謝物，其中12種在山藥皮中相對(duì)含量較高，包括C-hexosyl-chrysoeriol 7-O-hexoside、槲皮素-3-甲基醚、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸甲酯苷、Phellodensin F、鼠李素、Anisofolin A、柚皮苷、芹菜甙元4′-O-鼠李糖苷、異鼠李素、柚皮素等，它們使得山藥皮具有更強(qiáng)的抗氧化活性。此外，山藥皮中還富含維生素B、乙酰左旋肉堿、咪唑乙酸、反式玉米素-O-葡糖苷核苷、反式玉米素核苷、3-吲哚丁酸等代謝物。上述代謝物可以為山藥皮資源的有效利用提供物質(zhì)依據(jù)，從而延長(zhǎng)山藥加工產(chǎn)業(yè)鏈，提升山藥加工的附加值。

綜上所述，武穴薯蕷類野生山藥的山藥肉中富含纈氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸等多種氨基酸；相較于山藥肉，零余子中富含異柚葡糖苷、C-hexosyl-chrysoeriol 5-O-hexoside、扁蓄苷等18種黃酮類代謝物，山藥皮中富含反式玉米素-O-葡糖苷核苷、乙酰左旋肉堿、維生素B2、C-hexosyl-chrysoeriol 7-O-hexoside、槲皮素-3-甲基醚等代謝物。這些差異代謝物將為武穴薯蕷類山藥肉的營(yíng)養(yǎng)功效，以及山藥皮和零余子的有效利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。