王雅靜，李偉蘭，謝宗源，李 暉，胡 雷

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院1核磁室，2放療科，河北 唐山063000

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，高發(fā)于50～55歲，近年來(lái)其發(fā)病趨于年輕化［1］，全球每年宮頸癌新發(fā)病例約53萬(wàn)，死亡病例約27萬(wàn)［2］。同步放化療是治療宮頸癌的有效手段之一，若同步放化療首次治療失敗，后續(xù)治療將十分受限［3］。早期評(píng)估同步放化療獲益有著重要意義。

微小核糖核酸（miRNA）可通過(guò)調(diào)控靶基因參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程［4］。miR-3934作為miRNA家族中一員，已被報(bào)道與肺腺癌［5］、神經(jīng)母細(xì)胞瘤［6］和前列腺癌［7］等密切相關(guān)，但關(guān)于其與宮頸癌的關(guān)系還鮮有報(bào)道。針對(duì)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)腺癌（CESC）miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示miR-3934在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)；也有證據(jù)表明MRI參數(shù)可反映宮頸癌同步放化療療效［8］。但目前，臨床鮮有價(jià)值高的指標(biāo)預(yù)判宮頸癌同步放化療獲益。本研究主要分析miR-3934聯(lián)合MRI評(píng)估ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為前瞻性研究，選取2019年8月～2021年9月在華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院確診并接受治療的142例宮頸癌患者作為研究對(duì)象。ⅡB～Ⅲ期宮頸癌診斷參照《國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2018癌癥報(bào)告：宮頸癌新分期及診治指南》［9］。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次確診為宮頸癌；FIGO分期為ⅡB～Ⅲ期；接受同步放化療；同步放化療前未接受其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴血液系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)疾病；哮喘或其他惡性腫瘤；年齡及腫瘤病理信息不完整；中途退出研究者。

142例患者的年齡為32～70（54.36±8.06）歲；BMI為23.39（21.29，24.99）kg/m2；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）ⅡB期30例，ⅢA期39例，ⅢB期28例，ⅢC1期29例，ⅢC2期16例；腺癌38例，鱗狀細(xì)胞癌104例；腫瘤直徑5.7（4.8，6.2）cm；高分化62例，中分化51例，低分化29例。本研究受試者均簽署了知情同意書(shū)，符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 MRI檢查

于宮頸癌患者同步放化療前用Ingenia 3.0 T全數(shù)字MR掃描儀（飛利浦）和體部表面線圈行盆腔MRI常規(guī)平掃、擴(kuò)散加權(quán)成像（DWI）及動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像（DCE-MRI）掃描。MRI 常規(guī)平掃包括矢狀位、冠狀位、軸位T2WI和軸位T1WI序列，DWI（b值分別為0、1000 s/mm2）序列和DCE-MRI軸位序列（T1 THRIVE序列）。分別在DCE-MRI偽彩圖和ADC圖上測(cè)量回流速率常數(shù)（Kep）值、容積轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)（Ktrans）值、血管外細(xì)胞外間隙容積比（Ve）值和表觀彌散系數(shù)（ADC）值。某患者的MRI檢查圖像示意（圖1）。

圖1 某患者的MRI檢查圖像Fig.1 MRI images of a patient.

1.3 數(shù)據(jù)下載

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov）中下載關(guān)于CESC的312例樣本（含309例宮頸癌樣本和3例正常宮頸樣本）的miRNA表達(dá)的定量分析數(shù)據(jù)。

1.4 同步放化療方案及獲益評(píng)價(jià)

同步放化療方案：盆腔外照射放療聯(lián)合腔內(nèi)后裝放療，并同步化療。三維適形放療，2 Gy/次，5次/周，持續(xù)5 周；三維適形放療后用192Ir 腔內(nèi)放療，A 點(diǎn)劑量6～7 Gy/次，1次/周，共4～6次。順鉑劑量為40 mg/（m2·周），至放療結(jié)束。

獲益評(píng)價(jià)：用實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)［10］評(píng)價(jià)同步放化療獲益，完全緩解：腫瘤病灶消失，持續(xù)時(shí)間超過(guò)4周；部分緩解：腫瘤病灶縮小50%及以上，無(wú)新發(fā)腫瘤病灶，持續(xù)時(shí)間超過(guò)4周；疾病穩(wěn)定：腫瘤病灶縮小低于50%或增大低于25%，無(wú)新發(fā)腫瘤病灶，持續(xù)時(shí)間超過(guò)4周；疾病進(jìn)展：腫瘤病灶增大25%及以上或有新腫瘤病灶出現(xiàn)。

1.5 miR-3934水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-3934 水平。抽取宮頸癌患者同步放化療前（t0）、同步放化療第2天（t1）和同步放化療第8天（t2）的肘部靜脈血10 mL，4 ℃3000×g離心5 min，提取上層清液；用Trizol試劑提取血清中RNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度（本實(shí)驗(yàn)中RNA 的OD260/280值均為1.9～2.0）；用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；用PCR儀擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)條件95 ℃5 min，92 ℃30 s，65 ℃30 s，62 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。miR-3934上游序列：5'-GCCAGCTCCTACATCT CAGC-3'，下游序列：5'-AGCCTGACTTGCTAGTGG ATT-3'；內(nèi)參U6上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3'，下游序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。用2-DDct法計(jì)算miR-3934的相對(duì)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R4.1.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用edgeR包分析TCGA-CESC中miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)兩時(shí)點(diǎn)間的比較行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，t0、t1和t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934水平比較行重復(fù)測(cè)量方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩組間比較行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，兩組間比較行χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)t0、t1和t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的價(jià)值。采用Logistic回歸分析ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的風(fēng)險(xiǎn)因素，并構(gòu)建上述風(fēng)險(xiǎn)因素的列線圖回歸模型。用一致性指數(shù)（Cindex）評(píng)價(jià)模型的區(qū)分度，用校準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)模型精準(zhǔn)度，用決策曲線分析法評(píng)價(jià)模型臨床應(yīng)用價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA-CESC中差異miRNAs數(shù)據(jù)分析結(jié)果

TCGA-CESC 中共有110 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（foldchange=1，p.adj=0.05），其中46個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，64 個(gè)miRNAs 表達(dá)下調(diào)（圖2A）。宮頸癌組織中hsa-miR-3934表達(dá)水平高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（logFC=3.919，F(xiàn)DR=2.52E-04，P＜0.05，圖2B）。

圖2 TCGA-CESC差異miRNAs表達(dá)結(jié)果Fig.2 Results of differential miRNAs expression in TCGA-CESC.

2.2 兩組臨床特征比較

142例患者治療后完全緩解16例，部分緩解51例，疾病穩(wěn)定48例，疾病進(jìn)展27例。根據(jù)治療獲益情況將其分為獲益組（完全緩解+部分緩解，n=67）和非獲益組（疾病穩(wěn)定+疾病進(jìn)展，n=75）。兩組年齡、BMI、病理類型構(gòu)成和腫瘤直徑的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。獲益組的FIGO ⅡB期占比和高分化占比均高于非獲益組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比低于非獲益組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組的臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics of the two groups

2.3 兩組miR-3934水平比較

兩組miR-3934 水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.086，P＜0.001），獲益組t0、t1和t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934水平均低于非獲益組（t=5.778、6.222和9.421，P＜0.001）；兩組miR-3934 水平的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.794，P＜0.001），兩組的miR-3934水平隨時(shí)間進(jìn)展均呈降低趨勢(shì)，獲益組和非獲益組t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934水平均低于t0（t=5.593，P＜0.001；t=2.404，P=0.019）；時(shí)間和獲益不存在交互效應(yīng)（F=2.718，P=0.075），即獲益組和非獲益組的miR-3934水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［0.40（0.20，0.63）vs0.27（0.12，0.54），Z=1.518，P=0.129，表2］。

表2 兩組的miR-3934水平比較Tab.2 Comparison of miR-3934 in the two groups(Mean±SD)

2.4 兩組影像學(xué)參數(shù)比較

獲益組的Kep值、Ktrans值和Ve值均低于非獲益組，ADC值高于非獲益組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表3 兩組的影像學(xué)參數(shù)比較Tab.3 Comparison of imaging parameters between the two groups(Mean±SD)

2.5 miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的價(jià)值

t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的ROC曲線下面積（AUC）高于t0和t1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.204，P=0.028；Z=2.230，P=0.026）。t0和t1時(shí)點(diǎn)的miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.102，P=0.919，表4、圖3）。

表4 miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的價(jià)值比較Tab.4 Comparative value of miR-3934 in determining the benefit of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～I(xiàn)II cervical cancer

圖3 miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的ROC曲線Fig.3 ROC curve of miR-3934 in judging the benefit of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～I(xiàn)II cervical cancer.

2.6 ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的風(fēng)險(xiǎn)因素分析

分別以t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934、Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值的中位數(shù)為界值將上述變量轉(zhuǎn)換為二分類變量。將ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療是否獲益作為因變量，將FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、t2 時(shí)點(diǎn)的miR-3934、Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值作為自變量，變量賦值（表5），納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示FIGO Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度低、t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934＞2.66和Ktrans值＞0.59是ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），ADC值＞0.52是ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05，表6）。

表5 變量賦值Tab.5 Variable assignment

表6 ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的logistic回歸分析結(jié)果Tab.6 Logistic regression analysis results of benefits of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～I(xiàn)II cervical cancer

2.7 ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

構(gòu)建評(píng)價(jià)ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的模型A（由FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、Ktrans值和ADC值組成）和模型B（由FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、t2 時(shí)點(diǎn)的miR-3934、Ktrans值和ADC 值組成）（圖4A～B）。模型A評(píng)價(jià)ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的C-index為0.969，低于模型B（0.986）。模型A和模型B的校準(zhǔn)曲線（圖4C～D）。模型A的均方誤差和平均絕對(duì)誤差分別為0.00046和0.02，均低于模型B（0.00098和0.03）。

當(dāng)閾值概率在0.88～0.92時(shí)，模型A的臨床價(jià)值大于模型B；當(dāng)閾值概率在0～0.88或0.92～1時(shí)，模型B的臨床應(yīng)用價(jià)值大于模型A（圖4E）。

圖4 ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)Fig.4 Model construction and evaluation of the benefit of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～I(xiàn)II cervical cancer.

3 討論

同步放化療是ⅡB～Ⅲ期宮頸癌患者的首選治療方案，其治療療效與患者結(jié)局密切相關(guān)［9,11］。臨床中部分宮頸癌患者存在治療抵抗，治療后仍存在較大的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后的個(gè)體化差異較大［12］，因此，早期評(píng)估同步放化療獲益有利于進(jìn)一步強(qiáng)化治療。本研究主要分析miR-3934聯(lián)合MRI評(píng)估ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示獲益組t0、t1 和t2 時(shí)點(diǎn)的miR-3934水平均低于非獲益組，兩組miR-3934水平隨時(shí)間進(jìn)展均呈降低趨勢(shì)，獲益組和非獲益組t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934水平均低于t0，上述結(jié)果提示miR-3934水平與ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益有關(guān)，是其潛在的評(píng)價(jià)指標(biāo)。構(gòu)建評(píng)價(jià)ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的ROC曲線，結(jié)果顯示t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的AUC為0.857，高于t0和t1，提示t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934判斷ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的價(jià)值最大，因此將其納入Logistic回歸分析。對(duì)獲益組和非獲益組的Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示獲益組的Kep值、Ktrans值和Ve值均低于非獲益組，ADC值高于非獲益組，上述結(jié)果提示Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值可能與ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益有關(guān)。

采用Logistic回歸分析ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示FIGO Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度低、t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934＞2.66和Ktrans值＞0.59是ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ADC值＞0.52是ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療的獨(dú)立保護(hù)因素。既往已有多項(xiàng)研究報(bào)道FIGO分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度低與宮頸癌患者同步放化療治療反應(yīng)差有關(guān)［13-15］。Ktrans值反映的是對(duì)比劑從血管進(jìn)入組織間隙的速度，與組織血流量有關(guān)，多用來(lái)評(píng)估腫瘤病灶血管生成情況［16］。Ktrans值高，提示腫瘤病灶的血管完整性受到不同程度破壞，血管通透性增加［11］。ADC值可反映腫瘤病灶內(nèi)分子擴(kuò)散程度、水分子運(yùn)動(dòng)、血流狀態(tài)及癌細(xì)胞代謝功能等，其數(shù)值與放化療療效密切相關(guān)［17］。目前，已有多數(shù)學(xué)者將MRI的影像學(xué)參數(shù)應(yīng)用于宮頸癌患者治療反應(yīng)預(yù)測(cè)。有研究表明Ktrans值與局部晚期宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者同步放化療反應(yīng)有關(guān)，是預(yù)測(cè)局部晚期宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者同步放化療反應(yīng)的潛在指標(biāo)［18］；也有研究表明ADC值可反映宮頸癌患者同步放化療的療效，其值越大提示宮頸癌同步放化療療效越好［19］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。有證據(jù)表明鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后明顯強(qiáng)于腺癌［20］，本研究結(jié)果顯示病理類型與ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益無(wú)關(guān)，推測(cè)該差異與樣本量大小有關(guān)，后續(xù)還需增加樣本量進(jìn)一步分析。有研究報(bào)道，miR-3934與癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度有關(guān)，其可靶向腫瘤蛋白53誘導(dǎo)型核蛋白1參與A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［21］。此外，miR-3934還被報(bào)道與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)［6］。本研究推測(cè)miR-3934可調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡及對(duì)順鉑的敏感度，其水平與宮頸癌細(xì)胞對(duì)同步放化療的反應(yīng)有關(guān)，進(jìn)而反映同步放化療獲益情況。

本研究構(gòu)建了評(píng)估ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的模型，結(jié)果顯示模型A的C-index低于模型B，該結(jié)果提示模型B的區(qū)分度更好；模型A的均方誤差和平均絕對(duì)誤差略均低于模型B，該結(jié)果提示模型A的精準(zhǔn)度略佳。此外，在大部分閾值概率內(nèi)，模型B的臨床應(yīng)用價(jià)值大于模型A。綜上，認(rèn)為模型B更適用于宮頸癌同步放化療獲益評(píng)估。

綜上所述，由FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、t2時(shí)點(diǎn)的miR-3934、Ktrans值和ADC值組成的模型B評(píng)估ⅡB～Ⅲ期宮頸癌同步放化療獲益的價(jià)值較高，可輔助醫(yī)生決策。本研究因樣本量有限，未設(shè)置驗(yàn)證組，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證模型B的價(jià)值。