李坡，程威，王家強(qiáng)，姚偉濤，徐云強(qiáng)，李瑞欣，張西正

（1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 骨與軟組織科，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)鄭州人民醫(yī)院 骨科，河南 鄭州 450053；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 骨科，天津 300052；4.軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院衛(wèi)勤保障技術(shù)研究所 骨組織工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300161；5.天津市口腔醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，天津 300041）

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，將組織、基質(zhì)、生長因子、干細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)、材料科學(xué)和生物信息學(xué)等這些學(xué)科融合與應(yīng)用，以達(dá)到促進(jìn)組織修復(fù)和再生的目的［1］。通過處理組織工程材料，作為種子細(xì)胞良好的基質(zhì)，將細(xì)胞核生物材料共培養(yǎng)，加入生物活性因子或基因誘導(dǎo)劑或沉默劑，便于移入體內(nèi)，幫助恢復(fù)組織器官的結(jié)構(gòu)及功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內(nèi)存在的一類非造血干細(xì)胞，為起源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新層起源的多種細(xì)胞及多種間質(zhì)組織，如骨、軟骨、脂肪、韌帶、骨髓造血組織等［2］。間充質(zhì)干細(xì)胞的特性使其逐漸被用于更多的組織再生過程中。有研究表明，BMSCs甚至可以分化為神經(jīng)組織等［3］，具備多向分化潛能并可在不同調(diào)控下分化為中胚層。目前骨組織工程材料較多，各種有機(jī)材料如絲素蛋白、膠原蛋白以及無機(jī)材料羥基磷灰石等被大量研究。膠原蛋白大致分為3種，人體膠原蛋白形式主要以Ⅰ型膠原為主［4］，絲素蛋白衍生自天然蠶絲［5-6］，羥基磷灰石是人體骨主要的無機(jī)材料［7］。這3種材料有其優(yōu)缺點(diǎn)，通過將其復(fù)合能彌補(bǔ)單一材料的不足，是構(gòu)建骨組織工程的良好材料。本實(shí)驗(yàn)基于前期對(duì)材料相關(guān)研究［8］的基礎(chǔ)上，選取絲素、膠原蛋白以及羥基磷灰石3種材料，將其均勻混合，并根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)三維模型，將3種共混復(fù)合材料通過3D打印為三維多孔結(jié)構(gòu)材料。通過將提取的BMSCs接種到不同大小的支架上，探討本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)合仿生骨材料生物相容性及其成骨誘導(dǎo)性，為組織工程骨的篩選提供一種良好的、可降解的生物材料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 1月齡新西蘭大白兔1只，雄性，重量1.5 kg，由軍科院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK（津）：2016-0012。本研究通過軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物倫理審查。

1.2 主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），胎牛血清（優(yōu)級(jí)），胰蛋白酶（聯(lián)星生物制品有限公司），Percoll淋巴細(xì)胞分離液（Pharmacia公司），16號(hào)骨穿刺針（蘇州醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BMSCs的原代培養(yǎng) 在無菌條件下利用骨髓穿刺針穿刺麻醉好的新西蘭大白兔的脛骨上端，抽取骨髓約3 mL，與DMEM培養(yǎng)液1∶4稀釋成細(xì)胞懸液，在離心半徑為160 mm的離心機(jī)中，1 000 r·min-1離心5 min后重懸細(xì)胞。Percoll工作液分離重懸細(xì)胞，放置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度、37℃的孵箱中，24 h后半量換液，每3 d換液1次。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及組織化學(xué)特性鑒定 在培養(yǎng)的不同天數(shù)，利用倒置顯微鏡觀察BMSCs的貼壁情況、克隆形成以及不同代的骨髓干細(xì)胞增殖生長情況。取P3代BMSCs 80%融合的細(xì)胞爬片，經(jīng)過磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）漂洗，40 g·L-1的甲醛固定，1% TritonX-100、PBS漂洗，分別行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、糖原染色、脂肪染色、α-醋酸萘酚酯酶染色，以及兔抗CD44和CD54多克隆抗體（Ⅰ抗，賽默飛）、生物素化山羊抗兔IgG（Ⅱ抗，賽默飛）、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.3 絲素蛋白的制備及Ⅰ型膠原蛋白的制備 將蠶絲脫膠、干燥后備用。配制CaCl2·CH3CH2OH·H2O（1∶2∶8）三元溶液，溶解蠶絲，將溶解液透析、濃縮，得到穩(wěn)定的絲素蛋白溶液。將新鮮牛肌腱粉碎，通過浸泡及胃蛋白酶的乙酸溶液溶解，經(jīng)0.15 mol·L-1的NaCl溶液鹽析，透析后收集膠原蛋白。

1.3.4 絲素蛋白/Ⅰ型膠原/納米羥基磷灰石三維支架的制備 將絲素蛋白、Ⅰ型膠原、羥基磷灰石這3種生物材料按3∶9∶2混合，在乙酸中溶解均勻，利用設(shè)計(jì)軟件CAD設(shè)計(jì)3D支架模型，按照模型進(jìn)行低溫打印。經(jīng)過冷凍干燥3 d后，形成穩(wěn)定的三維立體支架，Co60滅菌后低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 三維支架的X衍射及紅外光譜分析 將三維支架粉碎成微小的顆粒，采用300目的濾網(wǎng)過濾，采用廣衍射角2θ為5°～90°，利用D8Advance型X射線衍射儀、Spectrum100紅外光譜儀及Origin8.0記錄超能探測計(jì)數(shù)器得到的衍射強(qiáng)度及紅外光譜。

1.3.6 BMSCs與支架復(fù)合培養(yǎng) 將融合度到80%的BMSCs接種到1cm支架和2cm支架的復(fù)合培養(yǎng)組以及不接種的空白組，按照每個(gè)支架1×105個(gè)接種。將3組置于放置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的孵箱中4h后，待細(xì)胞貼壁后加入培養(yǎng)基，定期更換。

1.3.7 三維支架上BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 在培養(yǎng)的不同時(shí)期，利用戊二醛、鋨酸將空白支架、細(xì)胞/支架復(fù)合物固定，利用掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）觀察細(xì)胞生長情況。將空白組及復(fù)合培養(yǎng)組用甲醛固定，染色，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）成像。

1.3.8 三維支架上BMSCs的增殖和ALP活性測定三維支架BMSCs上生長的第3、5、7、14天，用MTT及ALP測定試劑盒（南京，建成）測量細(xì)胞增殖活性及ALP活性。

1.3.9 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscription polymerasechainreaction，RT-PCR）及WB檢測成骨分化相關(guān)基因、蛋白水平 復(fù)合培養(yǎng)3d和7d后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，經(jīng)過RNA裂解液提取，逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛）及RT-PCR技術(shù)檢測ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）等目的基因的相對(duì)表達(dá)含量，利用一抗、二抗（賽默飛）及WB技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，本實(shí)驗(yàn)方法為多組設(shè)計(jì)，采用單因素方法分析（ANOVA）進(jìn)行比較，組間差異則進(jìn)一步采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定及細(xì)胞組織化學(xué)特性 培養(yǎng)2d，通過倒置顯微鏡可見部分細(xì)胞貼壁，部分細(xì)胞漂浮死亡（圖1A）。培養(yǎng)5～7d，通過倒置顯微鏡可見細(xì)胞較前明顯增多（圖1B）。培養(yǎng)14d，可見細(xì)胞體積變大，核/漿比大，核居中，細(xì)胞核疏松，少數(shù)細(xì)胞可見2～3個(gè)核仁，細(xì)胞長滿瓶底。常規(guī)傳代，傳至第6代，可見細(xì)胞克隆，體積擴(kuò)大，相互融合成片狀，細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形，邊緣圓潤（圖1C）。通過染色可見ALP染色（-）（圖1D），細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD54染色呈陽性（圖1E、1F），α-醋酸萘酚酯酶染色（+）（圖1G），糖原染色（+）（圖1H），脂肪染色（-）（圖1I）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞免疫組化染色

2.2 X-衍射及紅外光譜測定二級(jí)結(jié)構(gòu)變化 X-衍射（圖2A）結(jié)果顯示，混合材料主要在19.2°、45.12°、58.38°以及73.53°出現(xiàn)較強(qiáng)的衍射峰，說明復(fù)合支架主要以無規(guī)卷曲和α螺旋結(jié)構(gòu)共存。圖2A顯示3種材料混合后未產(chǎn)生新的衍射峰，未產(chǎn)生新二級(jí)結(jié)構(gòu)。在圖2B中可以觀察到此支架的吸收峰主要集中在1 635 cm-1（酰胺Ⅰ）、1 586 cm-1（酰胺Ⅱ）、1 102 cm-1（酰胺Ⅲ）以及701 cm-1（酰胺Ⅴ）處，這些是β-sheet吸收峰的主要所在位置。

圖2 三維支架的X-衍射及紅外光譜

2.3 SEM 及HE觀察細(xì)胞在支架表面的形態(tài) 將空白支架及細(xì)胞/支架復(fù)合物復(fù)合培養(yǎng)3 d后，SEM（圖3）顯示空白支架呈孔隙網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小為（506.37±60.35）μm，孔隙連通性良好，細(xì)胞可以良好黏附在支架上生長。HE（圖4）顯示，空白支架內(nèi)部疏松多空，細(xì)胞黏附于支架孔徑周圍生長，成梭形狀，2 cm支架培養(yǎng)組下?lián)軘?shù)目明顯多于1 cm支架培養(yǎng)組。

圖3 SEM觀察細(xì)胞在支架生長情況

圖4 HE染色觀察細(xì)胞在支架生長情況

2.4 復(fù)合支架上的成骨細(xì)胞增殖情況及ALP活性的測定 MTT（圖5A）及ALP（圖5B）結(jié)果顯示，復(fù)合培養(yǎng)組實(shí)驗(yàn)初期細(xì)胞增殖、ALP水平均大于空白組（P＜0.05），2 cm支架培養(yǎng)組實(shí)驗(yàn)晚期細(xì)胞增殖、ALP水平均大于1 cm支架培養(yǎng)組及空白組（P＜0.05）。

圖5 細(xì)胞增殖及ALP水平情況

2.5 復(fù)合培養(yǎng)對(duì)成骨分化相關(guān)基因、蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，在實(shí)驗(yàn)初期，復(fù)合培養(yǎng)組成骨相關(guān)基因表達(dá)水平高于空白組（P＜0.05），但復(fù)合培養(yǎng)組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在實(shí)驗(yàn)的晚期，2 cm 支架培養(yǎng)組成骨相關(guān)基因表達(dá)水平（ALP、OCN、BMP-2）高于1 cm支架培養(yǎng)組及空白組（P＜0.05）。蛋白水平表達(dá)情況及相對(duì)蛋白水平檢測結(jié)果如圖7A、7B所示，同mRNA水平變化一致。

圖6 復(fù)合培養(yǎng)下成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)情況

圖7 復(fù)合培養(yǎng)下成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

骨髓中有許多種細(xì)胞成分，除基質(zhì)細(xì)胞等已成熟分化的細(xì)胞外，還有BMSCs和造血干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞屬于混雜細(xì)胞群，它表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及表皮細(xì)胞的標(biāo)志，包括黏附分子（CD44、CD54、CD106等）、生長因子及其受體（白細(xì)胞介素-1受體、白細(xì)胞介素-2受體、IFN-CR等）、整合素家族及成員（CD29、CD49a等）以及其他表面標(biāo)志（CD90、CD105等）［9］。本實(shí)驗(yàn)所采用的CD44、CD54均為BMSCs的表面標(biāo)志，是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間進(jìn)行接觸和結(jié)合從而進(jìn)行信息交流的黏附分子表面抗原。CD54抗原為細(xì)胞間黏附分子，屬于免疫球蛋白超基因家族一員，由5個(gè)Ig樣位點(diǎn)功能區(qū)結(jié)構(gòu)，第一、二功能區(qū)為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1，在淋巴細(xì)胞和造血細(xì)胞的產(chǎn)生中發(fā)揮作用，以及參與并調(diào)控炎癥反應(yīng)，間接為BMSCs的歸巢創(chuàng)造了微環(huán)境［10］。

CD44是一類黏附分子家族的跨膜糖蛋白，具有Ⅰ型膠原蛋白、纖維粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)分子的結(jié)合位點(diǎn)，通過與骨架的作用以及胞體氨基酸磷酸化和去磷酸化，使BMSCs與胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合，從而激活體內(nèi)淋巴細(xì)胞、介導(dǎo)細(xì)胞間的多種信號(hào)傳導(dǎo)以及促進(jìn)細(xì)胞黏附等多種生物學(xué)功能［11］。目前未發(fā)現(xiàn)BMSCs的特異性標(biāo)志物。一般認(rèn)為細(xì)胞黏附分子CD44（HCAM）、CD54（ICAM-1）是BMSCs的重要標(biāo)志物［12-13］。

本文圖1顯示，細(xì)胞增殖到第6代后，BMSCs就開始逐漸各向分化，細(xì)胞核變大，各向異性增加，隨著傳代次數(shù)的增加，增殖能力逐漸降低，這也是目前限制BMSCs大量應(yīng)用的原因。目前骨組織工程中所用的材料有很多種，包括天然材料（蠶絲、膠原蛋白等）、合成材料（聚乳酸等）［14-16］及復(fù)合材料。但是單一的材料往往不能滿足細(xì)胞生長的需要［17-18］。因此，骨組織工程材料應(yīng)具有良好的性能及結(jié)構(gòu)，如在體內(nèi)為細(xì)胞提供黏附和生長的環(huán)境以及替代骨缺損部位的力學(xué)功能［19］。本課題組采用絲素蛋白、膠原蛋白、羥基磷灰石制備的三元復(fù)合材料，改變了降解、力學(xué)性能差、力學(xué)強(qiáng)度不足、材料脆性大等缺點(diǎn)［20］。在本文圖2中，利用X-衍射及紅外光譜可以知道，此三維支架主要以無規(guī)卷曲和α螺旋結(jié)構(gòu)及β-sheet共存，說明本實(shí)驗(yàn)材料在混合中未產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)，并且可以穩(wěn)定存在及結(jié)晶，為細(xì)胞植入支架提供了良好的空隙及支撐。本實(shí)驗(yàn)采用BMSCs體外培養(yǎng)，通過接種于支架上，觀察細(xì)胞的活性、黏附生長情況，經(jīng)過一系列體外生物相容性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，支架材料具有良好的生物相容性，無毒性，無免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)可以觀察到細(xì)胞良好生長在支架上，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，相關(guān)成骨基因及蛋白的表達(dá)量明顯升高。復(fù)合培養(yǎng)組雖然接種了相同的細(xì)胞數(shù)目，但在實(shí)驗(yàn)的中晚期，可以觀察到2 cm復(fù)合培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)目及成骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)均高于1 cm組。這可能是因?yàn)? cm支架提供了更充足的空間與黏附面積。因此，本實(shí)驗(yàn)的支架材料可很好地促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖以及分化，符合生物材料植入體內(nèi)的無細(xì)胞毒性和良好生物相容性的要求［21］。

本實(shí)驗(yàn)證明了制備絲素蛋白/膠原蛋白/羥基磷灰石復(fù)合材料具有良好的相容性，細(xì)胞能在支架上良好的黏附、增殖，細(xì)胞主要集中在支架的孔壁周圍，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)量以及蛋白表達(dá)量都逐漸升高，從而表明本實(shí)驗(yàn)室制備的支架有誘導(dǎo)成骨分化的能力。本實(shí)驗(yàn)制備的生物蛋白可降解支架可為組織工程骨的建成提供一種新的方式。