王艷麗， 朱曉青， 孫佳， 李勇軍， 劉春花， 陸苑**

(1.貴州醫(yī)科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫(yī)科大學 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球發(fā)病率第6、死亡率第4的惡性腫瘤疾病[1]，由于其具有較強的隱匿性，多數(shù)HCC患者就診時病情已達晚期[2]。盡管已經(jīng)研究出多種針對HCC的治療手段，但對于無法切除的中晚期HCC，可供選擇的治療方式非常有限，藥物化療依然是主要的手段[3]。阿霉素(doxorubicin, DOX)是HCC常用的化療藥物之一，但其臨床應(yīng)用受到以心臟毒性為主的多種毒副作用的限制[4]，DOX的主要活性代謝產(chǎn)物阿霉素醇(doxorubicinol, DOXol)是造成心臟毒副作用的主要原因[5]。艾迪注射液(aidi injection, ADI)是癌癥治療中常用的中藥制劑之一，由斑蝥、人參、黃芪、刺五加提取物組成，具有益氣扶正、祛邪攻毒的功效，在《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》(2019年版)中也明確將ADI納入輔助治療藥物之一[6]，研究認為ADI聯(lián)合化療藥物可降低后者的毒性，提高臨床療效，改善患者生存質(zhì)量[7-8]。長期聯(lián)合用藥時，中藥易對藥物代謝動力學的體內(nèi)過程產(chǎn)生影響，改變藥物體內(nèi)分布，影響治療效果甚至造成毒副作用[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ADI和DOX聯(lián)用時，ADI能夠顯著提高二乙基亞硝胺(n-nitrosodiethylamine，DEN)誘導的HCC大鼠體內(nèi)DOX和DOXol的血藥濃度[10]。鑒于有關(guān)ADI對DOX和DOXol在機體內(nèi)其它部位分布的研究報道較少，再加上DEN誘導的動物肝癌模型建模周期長、造模過程中死亡率較高等缺點[11-12]，本研究采用H22細胞肝癌模型小鼠，進一步探究ADI與DOX聯(lián)用對DOX和DOXol藥物的體內(nèi)分布影響，為ADI與DOX的合理臨床用藥方案奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1儀器 ACQUITY UPLC型超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜串聯(lián)儀(美國Waters)，F(xiàn)orma 905-ULTS1490型醫(yī)用低溫冰箱(美國 Thermo Fisher)，ALLEGRA X-30R型離心機(美國Beckman Coulter)，IMS-20全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)，KQ-300DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，ZH-2型渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)，XYN-15LP型氮吹儀氮氣發(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)。

1.1.2材料 H22小鼠肝癌細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司，艾迪注射液(批號20200303，規(guī)格10 mL/支)由貴州益佰有限責任公司提供，注射用鹽酸多柔比星(批號1910E1)購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，阿奇霉素(純度>98%，批號 J1229A)購于大連美侖生物科技有限公司，阿霉素醇對照品(純度>98%，批號 GC43565)購于美國 GlpBio公司，色譜級甲酸購于天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜乙腈購自德國Merck公司，其余溶劑均為分析純。

1.1.3實驗動物 SPF級雄性ICR小鼠(18～22 g)，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證編號SCXK(遼)2020-0001。動物于實驗前飼養(yǎng)在相對溫度18～25 ℃，相對濕度50%～70%的環(huán)境中，所有動物養(yǎng)護和實驗研究均嚴格遵守國家衛(wèi)生研究院動物養(yǎng)護和使用指南，并經(jīng)貴州醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(1801207)。

1.2 研究方法

1.2.1H22細胞培養(yǎng)及收集 H22細胞用含10%胎牛血清(FBS)和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，細胞懸浮生長，每2～3 d傳代1次；將細胞收集至離心管中，于1 000 r/min離心5 min，離心后吸去上清液，管底細胞沉淀加入適量培養(yǎng)基重懸后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；收集對數(shù)生長期細胞，通過臺盼藍進行染色，細胞存活率需大于95%，使用PBS調(diào)整細胞濃度至1×107個/mL，用于動物實驗。

1.2.2動物造模及分組給藥 取24只健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，取1.2.1項下獲得的H22細胞懸液0.2 m射于小鼠右側(cè)腋皮下，當小鼠腋下長出米粒大小包塊即造模成功。造模成功以后將小鼠隨機分為DOX單次給藥組(SDOX組)、DOX多次給藥組(MDOX組)和ADI聯(lián)合MDOX組(AMDOX組)，SDOX組連續(xù)14 d每天腹腔給予20 mL/kg生理鹽水、于第15天腹腔注射3 mg/kg DOX，MDOX組連續(xù)15 d隔天腹腔注射3 mg/kg的DOX，AMDOX組連續(xù)15 d每天腹腔注射20 mL/kg ADI，隔天腹腔注射3 mg/kg DOX，觀察各組小鼠的一般狀況。分別于末次給藥2 h后眼眶取血，在室溫下靜置約20 min，離心(3 000 r/min，20 min)后收集上清備用，于-20 ℃冷凍保存。脫頸處死小鼠，取腫瘤、心、肝、腎等組織，清洗殘血稱重后，將各組織與生理鹽水按1 ∶2的重量比進行勻漿，勻漿液于-20 ℃保存?zhèn)溆?，臨用前解凍。

1.2.3溶液配制及樣品處理 DOX標準溶液：精密稱取DOX對照品適量，加50%甲醇充分溶解，得1 g/L的 DOX儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。DOXol標準溶液：在1 mg的DOXol對照品瓶中加入50%甲醇1 mL充分溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL的容量瓶中定容至刻度，得200 mg/L的DOXol儲備液，分裝為1 mL/支，-80 ℃保存；取一支儲備液定容至10 mL，得濃度為20 mg/L的DOXol標準溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?內(nèi)標溶液配制：精密稱阿奇霉素適量至5 mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并定容至刻度，得100 mg/L的內(nèi)標溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4樣品處理 100 μL血清和組織勻漿液室溫融化后，加入20 μL的內(nèi)標溶液，用5%的甲酸甲醇500 μL進行蛋白沉淀，渦混1 min，于-20 ℃冷凍30 min，超聲5 min，14 000 r/min 離心10 min，上清液用氮氣吹干，殘渣溶于50%甲醇500 μL溶液中、14 000 r/min離心10 min，用UPLC-MS/MS分析。

1.2.5分析方法 根據(jù)課題組前期確定的分析方法進行本次實驗研究[10,13]，UPLC色譜條件采用Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相為0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫條件為0～0.5 min、10%～30% A，0.5～1.5 min、30%～60% A，1.5～2.0 min、60%～90% A，2.0～3.0 min、90%～10% A，3.0～4.0 min、10%～90% A，4.0～5.0 min、90%～5% A；柱溫45 ℃，流速0.35 mL/min，進樣體積2 μL。質(zhì)譜條件采用電噴霧電離源(ESI)，選擇多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)正模式；去溶劑氣氮氣，流速10 00 L/h，溫度600℃；碰撞氣氬氣，流速50 L/h；檢測離子DOX [M+H]+為m/z 544.7，DOXol [M+H]+為m/z 546.3，阿奇霉素[M+H]+為m/z 749.6，錐孔電壓分別為 25、30、30 V，碰撞電壓分別為 25、25、25 eV。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件對各組結(jié)果進行統(tǒng)計分析，P<0.05代表結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H22移植瘤小鼠體內(nèi)DOX的組織分布

與SDOX組小鼠比較，MDOX組小鼠各組織中DOX的含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與MDOX組比較，ADOX組小鼠腫瘤中DOX含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明ADI增強DOX腫瘤治療效果可能是通過增加DOX在靶部位藥物濃度而實現(xiàn)；ADI與DOX聯(lián)用后，DOX在其余組織中均表現(xiàn)出降低趨勢，其中以血清和心臟中變化最為顯著，說明ADI降低DOX的心臟毒性作用可能是通過降低DOX在心臟中的蓄積實現(xiàn)(由于血清中DOX和DOXol的含量相比其它組織較低，故圖中未表現(xiàn))。見表1和圖1。

表1 3組H22移植瘤小鼠各組織中DOX的含量(n=6)Tab.1 The concentrations of DOX in H22 HCC-bearing mice in each group(n=6)

注：(1)與SDOX組比較,P<0.05；(2)與MDOX組比較,P<0.05。圖1 H22移植瘤小鼠各治療組中阿霉素的分布Fig.1 Biodistribution of DOX in H22 HCC-bearing mice in each group

2.2 H22移植瘤小鼠體內(nèi)DOXol的組織分布

除DOXol在血清中的含量低于定量限外，其余組織部位均能準確檢測DOXol的含量。結(jié)果表明，與SDOX組小鼠比較，MDOX組小鼠各組織中DOXol的蓄積均明顯增加；聯(lián)合用藥后，DOXol除在腫瘤中的含量有增加趨勢外，其余組織中均表現(xiàn)出不同程度的降低，其中以心臟和肺的累計變化最為顯著，表明ADI發(fā)揮增效作用可能是通過提高DOXol在腫瘤部位的分布達到目的；此外，ADI還能在不同程度上減少DOXol在其它部位的蓄積。見表2和圖2。

表2 3組H22移植瘤小鼠各組織中DOXol含量Tab.2 The concentrations of DOXol in H22 HCC-bearing mice in each

注：(1)與SDOX組比較, P<0.05；(2)與MDOX組比較,P<0.05。圖2 H22移植瘤小鼠各治療組中阿霉素醇的分布(n=6)Fig.2 Biodistribution of DOXol in H22 HCC-bearing mice in each group(n=6)

3 討論

HCC是最常見的原發(fā)性肝癌，具有高復發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率、隱匿性強以及預后差等特點[2]。其發(fā)病機制復雜，治療選擇也趨于多樣化，目前主要包括手術(shù)切除、肝臟移植、局部消融、肝動脈介入、放射治療和全身療法[14]。在這些選擇中，盡管手術(shù)切除和肝移植是首選的治療方法，但卻只適用于15%的HCC患者[15]。多數(shù)患者就診時病情已達晚期，此時以藥物化療為主的全身治療最被認可[3]。然而多數(shù)化療藥物在治療的同時也被發(fā)現(xiàn)有嚴重的毒副作用，如阿霉素的累積心臟毒性會造成不可逆心衰[16]；5-氟尿嘧啶會造成神經(jīng)毒性和骨髓抑制[17]。

近年來，隨著對中醫(yī)藥研究的不斷深入，許多中藥制劑也被批準納入HCC治療方案[6]。實際應(yīng)用上，中藥常作為佐劑，在肝癌化療前后的輔助治療中，對肝癌化療后綜合征有明顯的緩解作用，一定程度上起到增效減毒的效果[18-19]。ADI作為腫瘤治療的常用中藥制劑，通常與阿霉素、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶和羥基喜樹堿等化療藥物聯(lián)合使用[20-21]。雖然臨床療效已被認可，但是聯(lián)合用藥中，ADI對于化療藥物影響的基礎(chǔ)研究卻較少。因此有必要通過動物肝癌模型研究中藥對化療藥物的體內(nèi)分布，為臨床用藥的安全性和有效性提供理論依據(jù)。

目前肝癌動物建模方法包括自發(fā)型、誘發(fā)型、移植型和轉(zhuǎn)基因等[22]?；瘜W誘導肝癌模型因為具有與人體肝癌相似的病變過程和病理學變化而被廣泛應(yīng)用[23]。前期研究中本研究也采用了DEN誘導大鼠HCC，但是由于造模周期較長(4個月)，存在較高的死亡率和成癌失敗率[24-25]，因此本研究考慮選用其它模型。移植型肝癌動物模型操作簡單、成本較低、造模成功率高、瘤體可見，且移植瘤可保持原有的特征和生物學特性基本不發(fā)生變化，成模較快，多用于藥物研究中小鼠肝癌模型的建立[10]。其中，H22腫瘤株建立的小鼠肝癌模型被認為是中醫(yī)藥研究抗腫瘤作用及機制的良好腫瘤模型[26]，故本研究采用H22小鼠移植瘤模型進行本實驗。

實驗結(jié)果表明，與SDOX組相比，多次給藥后DOX及其活性代謝產(chǎn)物DOXol在各組織中的分布量均顯著增加，證實了DOX的毒副作用與其體內(nèi)的蓄積量有關(guān)[27]。這提示當DOX連續(xù)用于腫瘤治療時，除能增強抗腫瘤效果外，還要特別注意藥物在其它部位的蓄積可能引起的不良反應(yīng)，尤其是DOX劑量依賴性心臟毒性和肝腎損傷等[28-29]。ADI與DOX聯(lián)合用藥后，DOX和DOXol在腫瘤部位的含量均有所增加；而在其它部位的分布減少，尤其以心臟中的變化最為明顯，表明ADI增強DOX抗腫瘤作用，降低DOX的心臟毒性作用可能是通過改變DOX和DOXol的體內(nèi)分布狀態(tài)實現(xiàn)。

肝臟作為藥物代謝的主要部位，直接影響藥物在體內(nèi)的藥代動力學行為。研究表明DOX主要經(jīng)羰基還原酶1(CBR1)、細胞色素P450(CYP450)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)代謝[30-31]。CBR1主要分布在心臟和肝臟中，是DOX代謝成DOXol的關(guān)鍵作用酶[32]，而DOXol是DOX誘導心臟毒性的主要原因，ADI聯(lián)合DOX給藥后，DOXol在心臟的含量顯著降低，表明ADI可能通過改變CBR1的表達降低DOX誘導的心臟毒性。同時前期實驗中本研究還發(fā)現(xiàn)ADI可下調(diào)大鼠肝組織中CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2、CYP2C11 mRNA和蛋白的表達[24]，并且通過降低GSTs的活性抑制DOX的體內(nèi)代謝[33]。此外，部分轉(zhuǎn)運體的活性或表達也被認為與DOX的體內(nèi)分布密切相關(guān)，DOX通過攝取性轉(zhuǎn)運體SLC22A16進入細胞內(nèi)；而P-gp則負責將細胞內(nèi)的DOX外排[34]，尤其是P-gp在肝癌細胞中存在高表達情況[35]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HCC大鼠體內(nèi)，SLC22A16的表達顯著降低，而 P-gp的表達則被明顯上調(diào)[13]。同時臨床研究指出ADI和化療藥物聯(lián)用時可以降低P-gp的表達[36]，而對于SLC22A16的影響則不清楚。綜上，這些都可能是ADI增加DOX抗腫瘤能力，降低DOX誘導心臟毒性的重要原因。

前期本研究課題組考察了DEN誘導的大鼠肝癌模型中，ADI可以顯著提高血漿中的DOX和DOXol水平[13]。這可能是因為DEN誘導的HCC過程，肝臟經(jīng)歷了“肝炎—肝硬化—肝癌”的三部曲，發(fā)生HCC時，其他肝臟組織可能正處于肝炎或肝硬化階段(也是嚴重病變)，各藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體處于異常狀態(tài)，其病變會很大程度影響藥物的體內(nèi)過程，從而使DOX代謝變慢。本實驗中本研究采用異位移植的H22小鼠肝癌模型，這種方法的肝臟是正常狀態(tài)。原發(fā)性肝癌和異位種植模型產(chǎn)生實驗結(jié)果的差異，可能是主要代謝器官肝臟處于不同模型狀態(tài)導致。這提示，肝癌動物模型各有特點，不同建模方法可以形成不同病理特點和生物特性，應(yīng)依據(jù)實際需要選用合適模型。

綜上所述，本研究采用UPLC-MS/MS考察了ADI和DOX聯(lián)用后對DOX和DOXol在血漿、腫瘤、心、肝、肺、腎中的分布情況，從藥物體內(nèi)分布情況角度上解釋了ADI與DOX發(fā)揮增效減毒作用的原因，為兩種藥物聯(lián)用的合理性奠定了理論基礎(chǔ)。