郭冬芬， 任真奎， 安小瓊， 陳明， 孫嫚彬，吳昌學(xué)*， 禹文峰*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州省第二人民醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科系， 貴州 貴陽 550004)

腦卒中是造成成人殘疾與死亡的主要疾病之一，目前臨床仍然沒有良好的預(yù)防與治療方案[1-2]，也沒有比較明確的早期輔助檢測的診斷指標(biāo)。轉(zhuǎn)錄測序是對生物基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)進(jìn)行的大規(guī)模檢測，可揭示生物在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生的差異表達(dá)。生物信息學(xué)作為一門新生學(xué)科，因為其擁有的強(qiáng)大數(shù)據(jù)支撐及復(fù)雜算法，近年來被廣泛運用于臨床醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的數(shù)據(jù)分析中[3]。對轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，能在一定置信度下縮小分析范圍，更精準(zhǔn)地找到研究目標(biāo)。近年來，利用轉(zhuǎn)錄測序結(jié)合生物信息學(xué)分析，試圖尋找診斷、預(yù)后和治療腦卒中標(biāo)志物，已然成為研究熱點[4-6]。有研究對腦缺血再灌注小鼠腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測序，并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在腦缺血再灌注后的神經(jīng)血管重塑中發(fā)揮重要作用[7]；而對腦缺血再灌注小鼠骨骼肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測序，結(jié)果顯示腦缺血性卒中小鼠模型中與蛋白水解和神經(jīng)肌肉連接相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化[8]；提示即使同樣是腦缺血再灌注小鼠模型，但因研究的側(cè)重點不同，也可能會得到不同的研究發(fā)現(xiàn)。因此本次實驗選取小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2進(jìn)行氧糖剝奪再灌注處理，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，希望找出因氧糖剝奪再灌注誘導(dǎo)的差異表達(dá)較大的基因，以期篩選出新的分子靶點，為腦卒中的研究提供新的研究思路及方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源、主要試劑與儀器

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購于中科院上海細(xì)胞庫。引物序列購于上海生工，cDNA逆轉(zhuǎn)試劑盒購于Takara公司，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)相關(guān)試劑購于Genstar，dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)完全培養(yǎng)基、無糖培養(yǎng)基及胎牛血清購于Gibico，實時熒光定量檢測儀器(Biorad)，-80 ℃冰箱(中國HAIER)，核酸定量儀(Thermo Fish Scientific)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 BV2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃，為正常組(control組)。待細(xì)胞密度生長至70%～80%，根據(jù)實驗需要選擇繼續(xù)傳代培養(yǎng)或用于實驗種板；將生長狀況良好的BV2細(xì)胞用胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；細(xì)胞懸液按(5～6)×107個/ L接種于6孔板中，待其密度生長至50%～60%時，將培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基，置于5% CO2、94%N2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，隨后用磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌3次，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即為氧糖剝奪再灌注組(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R組)。

1.2.2差異基因篩選及功能、通路富集分析 對轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，限定條件為log2(fold change)≤-5、或log2(fold change)≤5，P≤0.01，篩選出差異表達(dá)基因。在線網(wǎng)站(https://www.xiantao.love/products)對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO；包括細(xì)胞組成成分、分子功能以及生物功能分析)以及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。

1.2.3蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析 為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的分子間相互作用，在線網(wǎng)站String(https://cn.string-db.org/)對差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，cytoHubba插件對蛋白互作分析結(jié)果進(jìn)一步處理，篩選出在OGD/R組中評分較高的10個關(guān)鍵基因。

1.2.410個關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)檢測 qRT- PCR檢測經(jīng)cytoHubba插件篩選出的10個基因的mRNA表達(dá)水平。用TRIZOL分別提取control組、OGD/R組的總RNA并測定核酸濃度，取0.5～1 μg RNA按試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。得到的cDNA凍存于-80 ℃冰箱或用于后續(xù)的實時熒光定量實驗。進(jìn)行qRT- PCR時，按照試劑盒操作方案進(jìn)行模板、上下游引物、SYBR混合體系的配制，然后按照以下條件上機(jī)循環(huán)擴(kuò)增：95 ℃ 2 min，95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個循環(huán)；95 ℃ 5 s完成反應(yīng)。引物序列見表1，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算該10個關(guān)鍵基因的相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 OGD/R誘導(dǎo)基因差異表達(dá)

control組和OGD/R組的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，共檢測出22 621個基因，見圖1A。相較于control組，OGD/R組篩選出122個基因發(fā)生差異表達(dá)(P<0.01)，其中有108個基因表達(dá)上調(diào)，有14個基因表達(dá)下調(diào)，見圖1B。

注：A為轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果分析熱圖，B為差異基因火山圖。圖1 差異表達(dá)基因篩選Fig.1 Screening of differential expressed genes

2.2 差異表達(dá)基因的功能富集分析

GO分析結(jié)果顯示122個差異表達(dá)基因主要與受體配體激活、靜脈曲張、正調(diào)控STAT信號通路具有重要相關(guān)性(圖2A)。KEGG分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集到白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)信號通路中(圖2A)。在線網(wǎng)站String對122個差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析(圖2B)，cytoscope插件對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析計算 ，篩選出其中10個評分較高的關(guān)鍵基因(圖2C)，包括IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子(colony stimulating factor 3,Csf3)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(colony stimulating factor 2,Csf2)、Cd40 抗原(Cd40 antigen,Cd40)、IL-1β、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)、絲氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制劑B分支成員2(serine/cysteine peptidase inhibitor, clade B, member 2,Serpinb2)、IL-10、CXC基序趨化因子配體2 [chemokine (C-X-C motif) ligand2,Cxcl2]以及IL-12b。

注：A為GO和KEGG分析結(jié)果，B為蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，C為cytoHubba(插件)篩選結(jié)果。圖2 差異表達(dá)基因的功能富集分析Fig.2 Gene function enrichment analysis

2.3 qRT-PCR驗證差異表達(dá)的基因

qRT-PCR結(jié)果顯示，與control組比較，OGD/R組IL-6、IL-1β、Csf2以及Serpinb2 mRNA表達(dá)增加(圖3A)，IL-10、IL-12b、Cd40、Csf3、Cxcl2以及Ptgs2 mRNA表達(dá)降低(圖3B)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

腦卒中主要分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占所有腦卒中類型的80%[9- 10]，且具有高致殘、高致死、高復(fù)發(fā)的特點[11]，目前臨床用于治療腦卒中的主要方法是靜

注：A為OGD/R組表達(dá)上調(diào)的基因，B為OGD/R組表達(dá)下調(diào)的基因；與control組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 10個關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平Fig.3 mRNA expression level of 10 key genes

脈溶栓[12-13]和血栓取出術(shù)[14-15]，但這些治療方案仍面臨著多方面的問題。因而，繼續(xù)探索腦卒中的發(fā)病機(jī)制，尋找新的分子靶點對于治療腦卒中仍然具有重要意義。轉(zhuǎn)錄測序結(jié)合生物信息學(xué)分析能在具有一定可信度的條件下找到新的分子靶點，近年來在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)被廣泛運用[16-19]，通過對腦梗組和正常組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測序并對其進(jìn)行分析、驗證，試圖尋找腦卒中相關(guān)分子靶點[20-21]。

因此，本研究通過對control組及OGD/R組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相較于control，OGD/R組中存在大量差異表達(dá)的基因，其中表達(dá)差異大于五倍且具有統(tǒng)計學(xué)意義的基因有122個。針對這122個基因，進(jìn)行了更近一步的GO、KEGG以及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析，最后篩選出122個差異表達(dá)基因中10個評分較高的基因。并且qRT-PCR結(jié)果顯示，促炎因子IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)上調(diào)，抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)下調(diào)，表明OGD/R模型的建立成功[22-23]。Csf是一種集落刺激因子，其中Csf2為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，參與調(diào)控細(xì)胞的生存和增殖，在炎癥部位，它能通過募集髓樣細(xì)胞并增強(qiáng)其存活和活化而發(fā)揮促炎作用[24]。OGD/R處理后Csf2表達(dá)增加，參與OGD/R誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的放大，而Csf3表達(dá)發(fā)生下調(diào)。除此之外，qRT-PCR結(jié)果還顯示，Serpinb2 mRNA表達(dá)在OGD/R組發(fā)生明顯增加。有研究發(fā)現(xiàn)，在受到炎癥刺激時Serpinb2表達(dá)會明顯增加[25]。但是，同時Cd40、Ptgs2、Cxcl2、IL-12bmRNA表達(dá)發(fā)生下調(diào)。猜測這可能是由于細(xì)胞存在的自我調(diào)節(jié)作用，由于其他炎性指標(biāo)增加，細(xì)胞為了避免炎癥反應(yīng)的過度放大，保持動態(tài)平衡，從而促進(jìn)以上幾個炎性因子的表達(dá)下調(diào)，但這其中的機(jī)制還需要更進(jìn)一步的探索表明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)OGD/R處理會誘導(dǎo)大量基因差異表達(dá)，通過對轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果進(jìn)行分析可篩選出關(guān)鍵基因，進(jìn)一步的qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因發(fā)生差異表達(dá)，這對于進(jìn)一步探索腦卒中發(fā)病機(jī)制研究具有指示意義。