梁俊漪 鄭全輝

（華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000）

microRNA（miRNA）是高度保守的短18-25核苷酸非編碼RNA，可調(diào)控其靶基因的mRNA或蛋白表達(dá)[1]。有研究表明miR -150差異影響NK和iNKT細(xì)胞譜系的發(fā)育分化[2]。

與傳統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞相比，NKT細(xì)胞TCR不與經(jīng)典的MHC編碼的I類或II類分子呈遞的肽抗原相互作用，而是識別非經(jīng)典的抗原呈遞分子CD1 d呈遞的糖脂α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺（ α-Galcer）[3-4]。α-Galcer是iNKT細(xì)胞特異性激活劑，廣泛應(yīng)用于腫瘤、感染和自身免疫病等模型的干預(yù)研究[5]。

既往研究中如鄭全輝等發(fā)現(xiàn)，Mir-150 缺失小鼠血糖值增高，促進(jìn)小鼠Ⅰ型糖尿病的發(fā)生；α-Galcer促進(jìn)了Mir-150 缺失小鼠T1DM的發(fā)生。而高麗清等研究發(fā)現(xiàn)，α-Galcer降低了STZ誘導(dǎo)的Mir-150KO小鼠發(fā)生T1DM。以上有關(guān)Mir-150對小鼠TIDM研究主要采用雄性小鼠，而Mir-150和NKT細(xì)胞對雌性小鼠Ⅰ型糖尿病的影響尙不能明確。所以，在此研究中，采用雌性小鼠，STZ處理制備I型糖尿病模型，用α-Galcer處理，觀察NKT細(xì)胞激活對兩種雌性小鼠T1DM發(fā)生發(fā)展的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

（1）小鼠：雌性Mir-150基因敲除小鼠（Mir-150 knock-out,Mir-150KO）和野生型C57BL/6J小鼠最初購自Jackson實(shí)驗(yàn)室（Bar Harbor,ME,USA），小鼠在華北理工大學(xué)無致病性設(shè)施中飼養(yǎng)。小鼠實(shí)驗(yàn)操作按華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會規(guī)定進(jìn)行。（2）試劑：鏈脲佐菌素（STZ）、檸檬酸鈉和DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司，NKT細(xì)胞特異激活劑α-Galcer購自瑞典Larodon公司，血糖儀及試紙條購自瑞士羅氏公司，熒光素標(biāo)記的抗小鼠TCR-β 抗體（H57-597）和NK1.1抗體（PK136）購自美國BD 公司，鼠尾鑒定PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）miR-150KO小鼠基因型鑒定：miR-150KO小鼠基因型PCR鑒定以鼠尾DNA為模版，引物分別為：上游，5’-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3’；下游，5’-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3’。mi R-150 KO小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長度為262 bp的DNA 片段，對照C57BL/6J小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長度為866 bp的DNA片段。（2）小鼠分組：對于T1DM模型制備實(shí)驗(yàn)，選取5 ～8周齡雌性C57BL /6和Mir-150KO小鼠，分別分為STZ處理組和溶劑對照組。每組小鼠3 ～5只，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對于α-Galcer對T1DM影響實(shí)驗(yàn)，選取5 ～8周齡雌性C57BL /6和Mir-150KO小鼠，分別分為STZ單獨(dú)處理組和STZ加α-Galcer聯(lián)合處理組和溶劑對照組，每組小鼠6 ～8只，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。（3）小鼠糖尿病模型制作：實(shí)驗(yàn)組野生型C57BL/6和Mir-150KO小鼠腹腔注射濃度為1 mg/100μL的STZ，150 mg/kg一次造模，試劑對照組小鼠采用等量檸檬酸鈉緩沖液注射。取鼠尾血檢測血糖，開始每12 h測量1次，連續(xù)測量3 d后改為每三天測量一次，連續(xù)測量3周。小鼠糖尿病判斷標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)兩次測定血糖濃度大于12.0 mmol /L。（4）小鼠α-Galcer處理：首先，將α-Galcer溶于DMSO中配置成濃度為1μg/mL的溶液,再用PBS稀釋為濃度為6μg/100μL的溶液。注射α-Galcer，300 μg /kg，注射1次；溶劑對照組小鼠采用等量DMSO注射，注射1次。（5）流式細(xì)胞儀分析：分離小鼠的脾和淋巴結(jié)并制成單細(xì)胞懸液，用含2%小牛血清的PBS染色緩沖液洗滌，然后裂解紅細(xì)胞，再洗滌并重懸，取出適量濃度的細(xì)胞加入2.4G2封閉，4℃ 10 min，然后直接加入適當(dāng)濃度熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，4℃ 30 min。染色緩沖液洗滌兩次，采用BD-LSRⅡ流式細(xì)胞儀收集標(biāo)本，CellQuestPro （ BD Biosciences）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics統(tǒng)計軟件或Microsoft Excel 統(tǒng)計軟件組間差異t檢驗(yàn)，P＜0.05為組間有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Mir-150KO小鼠基因鑒定

Mir-150KO鼠尾DNA 經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生262 bp片段，對照C57BL /6J小鼠產(chǎn)生866 bp片段，miR-150KO小鼠基因鑒定正確，如圖1所示。

圖1 MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J小鼠基因型鑒定

2.2 Mir-150敲除促進(jìn)小鼠糖尿病的發(fā)生

從STZ注射第0 d開始分別測量各組小鼠血糖變化，結(jié)果如圖2所示。溶劑對照組Mir-150KO小鼠在實(shí)驗(yàn)期間的血糖水平始終略高于相應(yīng)C57BL/6J小鼠，這與以前的報道一致。與溶劑對照組小鼠相比，STZ處組小鼠Mir-150KO和C57BL/6J小鼠血糖水平均增加。STZ處理中，Mir-150KO小鼠血糖水平均比C57BL /6J小鼠顯著增高（*P＜0.05）。如圖3所示，STZ注射組T1DM發(fā)病率Mir-150KO小鼠明顯高于C57BL/6小鼠（*P＜0.05）。

圖2 MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J小鼠的血糖變化

圖3 小鼠T1DM發(fā)病率變化

2.3 α-Galcer處理降低雌性Mir-150KO和C57BL/6J小鼠的TIDM發(fā)生率

α-Galcer處理可顯著增加Mir-150KO和C57BL/6J小鼠NKT細(xì)胞水平，如圖4，差異明顯（*P＜0.01）。用α-Galcer與STZ同 時 處 理Mir-150KO和C57BL/6J小鼠，3周后檢測各組小鼠血糖，結(jié)果如圖5所示，STZ注射組C57BL/6J和Mir-150KO小鼠的發(fā)病率明顯低于α-Galcer與STZ同時處理組的小鼠（*P＜0.05）。

圖4 經(jīng)α-Galcer處理后Mir-150KO和C57BL /6J小鼠NKT細(xì)胞水平變化

圖5 用α-Galcer與STZ同時處理Mir-150KO和C57BL/6J小鼠3周后血糖變化

2.4 NKT的細(xì)胞激活使Mir-150敲除小鼠的死亡率升高

研究發(fā)現(xiàn)，α-Galcer注射12 h左右后小鼠有死亡的現(xiàn)象，但是注射STZ的小鼠和溶劑對照組小鼠并沒有發(fā)生死亡。其中，Mir-150KO小鼠中注射STZ+α-Galcer的死亡率最高為60%，如圖6所示，α-Galcer的注射也就是NKT的細(xì)胞激活使Mir-150敲除小鼠的死亡率顯著升高（*P＜0.05）。

圖6 α-Galcer注射12 h左右小鼠生存情況

2.5 Mir-150 敲除小鼠注射后12 h血糖下降

將小鼠分為MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J小鼠兩組。每組小鼠分別注射STZ+α-Galcer和單獨(dú)STZ。從0 h開始每12 h測一次非空腹血糖，直至測量到144 h結(jié)束。如圖7所示，注射STZ+α-Galcer的小鼠在12 h時血糖濃度下降到最低點(diǎn)2.1 mM。而單獨(dú)注射STZ的小鼠并沒有出現(xiàn)此現(xiàn)象（*P＜0.05）。

圖7 注射STZ+α-Galcer的小鼠在12 h時血糖濃度變化

3 討論

與以往的研究不同，本次實(shí)驗(yàn)采用了雌性小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，雌性Mir-150敲除的小鼠T1DM 的發(fā)生率，明顯要高于C57BL/6J小鼠。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過α-Galcer激活自然殺傷性T細(xì)胞可防止自身免疫性1型糖尿病的發(fā)作和復(fù)發(fā)。造模后注射α-Galcer激活NKT細(xì)胞，T1DM的造模率確實(shí)比不注射時降低了，可以說NKT細(xì)胞的激活對糖尿病的發(fā)生起抑制作用。

當(dāng)采用α-Galcer激活NKT細(xì)胞后，與雄性小鼠反應(yīng)相似，無論是Mir-150 KO小鼠還是C57BL/6J小鼠，STZ誘導(dǎo)的TIDM發(fā)生率都有所降低。同時研究發(fā)現(xiàn)，雌性Mir-150KO小鼠與相應(yīng)處理C57BL/6J小鼠相比死亡率顯著升高。這個現(xiàn)象是雄性小鼠所沒有的。

后續(xù)為了研究雌性Mir-150小鼠在α-Galcer處理后的死亡的原因，每12 h測量小鼠的血糖變化。研究發(fā)現(xiàn)，造模注射STZ后的12 h左右，注射α-Galcer的小鼠，MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J均出現(xiàn)血糖下降過低的狀態(tài)。未注射α-Galcer的小鼠則不明顯。Mir-150小鼠的死亡與血糖濃度過低有關(guān)。