江沂， 劉燕娣， 劉婉， 陳海敏

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 病理科， 廣東 廣州 510130)

阿爾茨海默氏病(alzheimer’s disease，AD)是老年性癡呆最常見類型之一，以認(rèn)知和記憶功能進(jìn)行性減退為主要臨床特征，其主要病理特征包括細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β amyloid protein, Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque, SP)、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)及腦萎縮[1]。Aβ的聚集是AD發(fā)生和發(fā)展的核心因素，可直接或間接破壞突觸的結(jié)構(gòu)和功能，引起突觸功能障礙和突觸丟失[2-3]。突觸正常功能的發(fā)揮及可塑性的維持與突觸相關(guān)蛋白密切相關(guān)，已知突觸相關(guān)蛋白主要有突觸素(synapsin, SYN)、突觸后致密蛋白95(postsynaptic density of 95, PSD95)、發(fā)動(dòng)蛋白1(dynamin, DYN1)等[4]。天麻(gastrodiae rhizome, GR)是我國珍貴的藥食同源中藥，天麻素(gastrodin, GAS)、香莢蘭醇(vanillyl alcohol)、香莢蘭醛(vanillin)是其有效化學(xué)成分，大約在兩千多年前就被神農(nóng)草藥經(jīng)典所記載，具有腦神經(jīng)保護(hù)作用。有關(guān)GAS的研究表明，其藥理效應(yīng)眾多，包括增強(qiáng)認(rèn)知功能、抗炎、抗氧化、抗抑郁和抗焦慮等，且無其它不良反應(yīng)[5-6]。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma cell, SH-SY5Y)細(xì)胞為研究對(duì)象，采用安全濃度的GAS單獨(dú)或聯(lián)合Aβ1-42處理，觀察處理后突觸相關(guān)蛋白SYN、DYN1及PSD95 mRNA及蛋白表達(dá)改變，探討GAS對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸蛋白水平的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

GAS購買自貴州益康制藥有限公司，經(jīng)鑒定符合企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)；SH-SY5Y細(xì)胞購于德國German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司，鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體、HRP標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology Inc公司。兔抗Synaptophysin多克隆抗體(ab32594)購自美國Abcam公司；兔抗PSD95多克隆抗體(GTX133091)、兔抗DYN1多克隆抗體(GTX110379)購自美國Gene Tex公司；SYN、DYN1、PSD95及β-actin的引物均由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 研究方法

1.2.1Aβ寡聚體的制備[7]將0.1 mg的Aβ1-42溶于220 μL的六氟異丙醇 (hexafluoroisopropanol, HFIP)，使其濃度為0.1 mmol/L，混勻、室溫放置1 h后，冰上放置10 min，分裝于1.5 mL的 Epp 管中，通風(fēng)櫥過夜，Epp 管底部可見白色的薄膜，放置-80 ℃?zhèn)溆谩＜?xì)胞處理前，溶于二甲基亞砜 (DMSO) 中，使其終濃度為 5 mmol/L，用改良的 Dulbecco Eagle 培養(yǎng)基稀釋， 4 ℃下孵育24 h后處理細(xì)胞。

1.2.2CCK8法篩選GAS安全濃度 為篩選GAS處理SH-SY5Y細(xì)胞的安全濃度，選擇0、25、50、75、100、125、150、175及200 μmol/L GAS處理SH-SY5Y 細(xì)胞24 h，采用CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞活力，觀察GAS對(duì)細(xì)胞的毒性作用，篩選GAS安全濃度。

1.2.3細(xì)胞分組及藥物干預(yù) 取4 ℃下孵育 24 h后的SH-SY5Y細(xì)胞分為對(duì)照組(不經(jīng)處理SH-SY5Y細(xì)胞，再培養(yǎng)48 h)、Aβ組(經(jīng)5 μmol/L Aβ1-42寡聚體處理48 h)、GAS組(加入50、85及120 μmol/L的GAS 培養(yǎng)48 h)及Aβ+GAS組(先加入85 μmol/L GAS 預(yù)培養(yǎng)24 h 后，再按照Aβ組方法處理細(xì)胞)。

1.2.4SYN、DYN-1、PSD-95 mRNA水平 參照文獻(xiàn)方法[8]， 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 再以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。SYN、DYN-1、PSD-95及β-actin的引物序列見表1。運(yùn)用ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采集基因擴(kuò)增各循環(huán)的熒光信號(hào)，以Applied Biosystems SDS 2.1軟件收集熒光并分析數(shù)據(jù)。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算各基因在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的相對(duì)水平(RQ=2-ΔΔCt)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5SYN、DYN1及PSD95蛋白水平 參考文獻(xiàn)[8]提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白SYN、DYN1及PSD95的表達(dá)水平。用Bandscan 軟件以β- actin 蛋白條帶作為內(nèi)參照進(jìn)行結(jié)果分析，以各蛋白與β-actin 蛋白條帶像素灰度的百分比值作為SYN、DYN1及PSD95蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段Tab.1 Primer sequence and product fragment of quantitative fluorescence PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GAS安全作用濃度

如圖1所示，GAS濃度≥150 μmol/L時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞活力開始出現(xiàn)下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明>150μmol/L時(shí)的GAS對(duì)細(xì)胞增殖能力有一定影響;0～150 μmol/L GAS范圍時(shí)細(xì)胞活力無明顯變化，表明在這一濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力影響較小，可作為GAS處理細(xì)胞的安全濃度。

圖1 GAS安全作用濃度篩選Fig.1 Concentration screening of GAS safety action

2.2 GAS對(duì)細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

選用50、85及120 μmol/L的GAS分別處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定突觸相關(guān)蛋白SYN、DYN1及PSD95 mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示隨著GAS處理濃度的升高，SH-SY5Y細(xì)胞的SYN、DYN1及PSD95 mRNA及蛋白水平均上調(diào)(P<0.05)，并隨著GAS濃度的升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)，B、C為細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白表達(dá)；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05，(2) P<0.01。圖2 GAS對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞PSD95、SYN及DYN-1水平的影響Fig.2 Effects of GAS on the levels of PSD95, SYN, and DYN-1 in SH-SY5Y cells

2.3 GAS對(duì)抗Aβ 對(duì)細(xì)胞觸相關(guān)蛋白mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，5 μmol/L Aβ1-42處理細(xì)胞后引起SYN、DYN1、PSD95 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；說明Aβ通過降低突觸蛋白水平發(fā)揮其毒性作用；用85 μmol/L GAS處理細(xì)胞后，與Aβ組比較，Aβ+GAS組細(xì)胞SYN、DYN1、PSD95 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；說明GAS可減弱Aβ1-42對(duì)細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白的下調(diào)作用。

注：A為細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)，B、C為細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白表達(dá)；(1)與對(duì)照組比較， P<0.01;與Aβ 組比較，(2) P<0.05，(3) P<0.01。圖3 GAS對(duì)抗Aβ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of GAS against Aβ on the expression of synapse-related proteins in SH-SY5Y cells

3 討論

AD 是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要特征是認(rèn)知功能緩慢性進(jìn)行性喪失，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力降低，社會(huì)交往和適應(yīng)能力降低，性格和精神異常[9]。Aβ 在細(xì)胞外沉積形成的老年斑是AD 的主要病理特征之一，在 AD 的發(fā)病中一直被認(rèn)為起著重要的作用[10]，有研究證實(shí)Aβ 神經(jīng)毒性作用及在 AD 發(fā)病中的重要作用，進(jìn)一步研究Aβ 毒性作用的機(jī)制，可為 AD 治療提供靶點(diǎn)依據(jù)；尋找到能有效對(duì)抗其神經(jīng)毒性作用，具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物也是研究的重點(diǎn)。

突觸是神經(jīng)元之間信息主要通過突觸傳遞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變與認(rèn)知功能的降低關(guān)系密切，而且其改變?cè)缬趶V泛的神經(jīng)元變性[11]。研究表明，海馬神經(jīng)元的突觸可塑性變化以及突觸丟失在AD的早期病理過程中占據(jù)著重要地位，與 AD 學(xué)習(xí)和記憶功能障礙密切相關(guān)[12]。Aβ 寡聚體聚集及其神經(jīng)毒性刺激引起的突觸功能損傷和數(shù)量減少與 AD 病程進(jìn)展緊密相關(guān)[13]，因此尋找對(duì)抗Aβ突觸毒性作用的藥物可能在AD的治療中起著重要作用[14]。SYN和PSD95 是突觸的特異性標(biāo)志物，在維持突觸正常功能和可塑性方面具有重要作用，其表達(dá)下降意味著突觸的丟失[15]。有研究顯示，AD患者認(rèn)知功能下降與突觸囊泡回收蛋白表達(dá)異常有關(guān)。網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞過程構(gòu)成了突觸囊泡的循環(huán)回收，多種蛋白參與其中共同協(xié)調(diào)完成，DYN1便是其中之一，參與到網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的突觸囊泡的內(nèi)吞過程。有研究表明隨著APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠月齡的增加，Aβ的沉積增多，海馬神經(jīng)細(xì)胞突觸蛋白水平明顯降低，且與 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙密切相關(guān)，說明Aβ可能通過降低細(xì)胞突觸蛋白的水平來發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用[16]。

GAS是GR中活性成分含量最高的有效單體成分，具有包括抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗焦慮等多種藥理學(xué)作用。有學(xué)者采用最大耐受量 (MTD) 試驗(yàn)觀察GAS軟膠囊的亞急性毒性和急性毒性，在小鼠各臟器中均未檢測(cè)到明顯的病理學(xué)改變，表明GAS軟膠囊在用藥過程中不會(huì)產(chǎn)生明顯毒副作用[17-18]。同時(shí)GAS也是一種強(qiáng)抗氧化劑，可降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，提高抗氧化蛋白表達(dá)[19]。也有研究表明GAS可以明顯改善 AD 動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶障礙[20]，說明GAS具有增強(qiáng)認(rèn)知能力的作用。而突觸蛋白水平與學(xué)習(xí)記憶障礙密切相關(guān)，GAS改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用是否與其調(diào)控突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，GAS在高濃度使用時(shí)對(duì)細(xì)胞均無明顯毒性作用，說明其安全性較好，這與其他研究一致[5-6]。本研究還發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42能夠明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白 SYN、DYN1及 PSD95 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平，提示GAS能夠明顯地上調(diào) SYN、DYN1及 PSD95 表達(dá)水平，并能對(duì)抗Aβ1-42寡聚體所導(dǎo)致這3種突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的降低，進(jìn)一步提示GAS可以通過上調(diào)突觸蛋白表達(dá)的作用來改善學(xué)習(xí)記憶功能，可能在 AD 的治療中具有重要的作用，值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

綜上所述，GAS具有上調(diào)SYN、DYN1及PSD95 表達(dá)的作用，在安全濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性關(guān)系; 天麻素在細(xì)胞整體水平有抗Aβ 的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，其作用機(jī)制可能與其對(duì)抗Aβ 引起的突觸相關(guān)蛋白表達(dá)降低有關(guān)，可能在AD 的中藥治療中發(fā)揮重要作用。