黃瑾瑾， 楊宇石， 孫紫君， 范夢蕾， 李翀瑤， 薄莉， 李小虎， 徐澍**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴陽市第二人民醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽 550004)

乳腺癌(carcinoma of breast)來自乳腺終末導(dǎo)管小葉單元，是全世界女性最常見的腫瘤，也是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因[1]?，F(xiàn)階段，乳腺癌治療方式多樣，但是對于轉(zhuǎn)移性乳腺癌，已有的各種治療手段的效果并不理想。三陰性乳腺癌，因缺乏ER、PR和HER-2表達(dá)，失去了內(nèi)分泌治療機(jī)會，只能采取手術(shù)和療效有限且副作用大的傳統(tǒng)放化療等方式治療[2]。因此，探索新的治療方式就對乳腺癌患者尤為重要。研究表明，腫瘤微環(huán)境可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，改變腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage,TAM)是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，具有高可塑性，可經(jīng)過經(jīng)典激活途徑極化為M1型，促進(jìn)炎癥及抗腫瘤作用，或是經(jīng)過替代激活途徑極化為M2型，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境免疫反應(yīng)，與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲息息相關(guān)[3]。CD163屬于半胱氨酸家族成員的血紅蛋白清除劑受體，是M2型TAM特異性蛋白標(biāo)記[4]。在結(jié)直腸癌[5]和胃癌[6]等腫瘤研究中，CD163標(biāo)記M2型TAM表達(dá)密度越高、數(shù)量越多，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，患者預(yù)后越差；但是CD163在乳腺癌機(jī)制研究中存在爭議。本研究采用免疫組化方法檢測乳腺癌中CD163標(biāo)記M2型TAM以及CD31標(biāo)記的微血管密度(microvessel density，MVD)，探討CD163標(biāo)記M2型TAM和CD31標(biāo)記MVD與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

通過電話或門診隨訪2012年1月—2014年12月病理科診斷的625例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，隨訪時(shí)間最長94個(gè)月、中位隨訪時(shí)間68個(gè)月，隨訪期間收集患者有無復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡等資料。隨訪時(shí)間截止至2019年8月，有效隨訪患者138例(全部為女性)，收集年齡、月經(jīng)情況、腫瘤直徑、TNM分期、Ki-67表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理特征；138例患者術(shù)前均未行放化療及內(nèi)分泌等治療，年齡27～75歲，平均49歲、中位年齡48歲；收集腫瘤直徑資料及TNM分期共109例，缺失29例，其余資料完整。收集存檔切片，由兩位乳腺病理專業(yè)主任醫(yī)師根據(jù)中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2019年版)診斷標(biāo)準(zhǔn)使用雙盲法重新判讀并分級[2]，其中Luminal A型24例(ER/PR陽性，且PR陽性率>20%,HER-2陰性，Ki67增殖指數(shù)<20%)，Luminal B樣HER-2陰性型32例(ER/PR陽性，且PR陽性率<20%,Ki67增殖指數(shù)≥20%，HER-2陰性)，Luminal B樣HER-2陽性型26例(ER/PR陽性，HER-2陽性)，HER-2陽性型22例(ER和PR均陰性，HER-2陽性)，三陰性乳腺癌34例(ER、PR及HER-2均陰性)。138例納入樣本為癌組織組，35例癌旁正常乳腺組織作為對照(癌旁正常組織組)。

1.2 研究方法

1.2.1切片處理 鼠抗人單克隆抗體CD163一抗(北京中杉金橋，ZM-0428)，鼠抗人單克隆抗體CD31一抗(北京中杉金橋，ZM-0044)，檢測滴度均為1 ∶100，免疫組化染色采用EnVision法。切片脫蠟脫水后，EDTA抗原修復(fù)液(pH 9.0)高壓修復(fù)5 min，PBS沖洗3×3 min后，滴加過氧化氫孵育20 min，PBS沖洗3×3 min，山羊血清封閉20 min，一抗孵育過夜；復(fù)溫50 min后，PBS沖洗3×3 min，二抗37 ℃孵育20 min(北京中杉金橋，PV-9000)，PBS沖洗后DAB顯色3 min，蘇木素復(fù)染后封固。

1.2.2結(jié)果判讀 CD163和CD31在胞膜和胞漿中出現(xiàn)粗顆粒狀和片狀的黃色或棕黃色著色為陽性，免疫組化結(jié)果由2位主任病理醫(yī)師雙盲法按照以下標(biāo)準(zhǔn)評分：(1)CD163在癌組織組及癌旁正常組織組的判讀，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)間質(zhì)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)1/1000為陽性百分率，陽性百分率評分標(biāo)準(zhǔn)定位0分(<1%)、1分(1%～10%)、2分(11%～25%)、3分(26%～50%)及4分(>50%)；根據(jù)組織染色強(qiáng)度評分為陰性0分，點(diǎn)狀淡黃色1分，粗顆粒狀和片狀黃色2分，棕黃色3分；強(qiáng)度和百分比的乘積作為免疫組化結(jié)果評分(IRS)，CD163標(biāo)記M2型TAM≤6分為低表達(dá)，CD163標(biāo)記M2型TAM>6分為高表達(dá)[7]；(2)CD31標(biāo)記MVD免疫組化判讀參照Weidner校正方法，取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)微血管數(shù)量，取其平均值為CD3l標(biāo)記MVD值，統(tǒng)計(jì)所有病例的CD31標(biāo)記MVD值，中位數(shù)為15，<15個(gè)為低密度，≥15個(gè)為高密度[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件對所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用χ2檢驗(yàn)及Spearman法分析CD163標(biāo)記M2型TAM和CD31標(biāo)記MVD表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，使用Spearman法分析CD163標(biāo)記M2型TAM和CD31標(biāo)記MVD相關(guān)性，利用Kaplan-Meier法分析CD163標(biāo)記M2型TAM表達(dá)和CD31標(biāo)記MVD與預(yù)后的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD163標(biāo)記M2型TAM及CD31標(biāo)記MVD在癌組織組與癌旁正常組織組的表達(dá)

CD163標(biāo)記M2型TAM和CD31標(biāo)記MVD在癌組織組高表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 CD163標(biāo)記M2型TAM及CD31標(biāo)記MVD在癌組織組與癌旁正常組織組中的表達(dá)Tab.1 The expressions of CD163 labeled M2 type TAM and CD31 labeled MVD in the cancer tissue group and the control group

注：A為高表達(dá)(400×)，B為低表達(dá)(400×)，C呈高密度(200×)，D呈低密度(200×)。圖1 癌旁正常組織及癌組織中CD163標(biāo)記M2型TAM和CD31標(biāo)記MVD的表達(dá)Fig.1 CD163 labeled M2 type TAM expression and CD31 labeled MVD in adjacent normal tissues and cancer tissues

2.2 CD163標(biāo)記M2型TAM與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

CD163標(biāo)記M2型TAM在病理組織學(xué)分級Ⅲ級中高表達(dá)率明顯高于Ⅰ級和Ⅱ級，在Ki-67增殖指數(shù)≥20%者高表達(dá)率明顯高于Ki-67增殖指數(shù)<20%者，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高表達(dá)率明顯高于無轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD163標(biāo)記M2型TAM在Luminal B樣HER-2陰性型、Luminal B樣HER-2陽性型、HER2陽性型和三陰性型乳腺癌高表達(dá)率均明顯高于Luminal A型，其中HER-2陽性型高表達(dá)率明顯高于其他分子分型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD163標(biāo)記M2型TAM的表達(dá)在不同患者年齡、月經(jīng)狀況、TNM分期、腫瘤大小、復(fù)發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡等特征中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 CD31標(biāo)記MVD與癌組織組患者臨床病理特征的關(guān)系

CD31標(biāo)記MVD在腫瘤直徑>5 cm者高密度表達(dá)率明顯高于腫瘤直2.0<～≤5 cm者和腫瘤直徑≤2.0 cm者，在Ki-67增殖指數(shù)≥20%者高密度表達(dá)率明顯高于Ki-67增殖指數(shù)<20%者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD31標(biāo)記MVD在Luminal B樣HER-2陰性型、Luminal B樣HER-2陽性型、HER2陽性型和三陰性型乳腺癌中高密度表達(dá)率均高于Luminal A型，尤其在三陰性乳腺癌中高密度表達(dá)率更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD31標(biāo)記MVD的表達(dá)在不同患者年齡月經(jīng)狀況、TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡等特征中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4 乳腺癌患者CD163標(biāo)記M2型TAM與CD31標(biāo)記MVD相關(guān)性

癌組織組內(nèi)CD163標(biāo)記M2型TAM表達(dá)與CD31標(biāo)記MVD呈正相關(guān)(r=0.180，P<0.05)，見表3。

2.5 癌組織組CD163標(biāo)記M2型TAM與CD31標(biāo)記MVD與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，CD163標(biāo)記M2型TAM及CD31標(biāo)記MVD與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者預(yù)后無關(guān)(P>0.05),見圖2、圖3。

3 討論

體液循環(huán)中單核細(xì)胞在單核細(xì)胞集落刺激因子作用下被募集到腫瘤微環(huán)境成為TAM。巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體(TLR)、脂多糖及T輔助細(xì)胞1(Th1)細(xì)胞因子受體與病原體結(jié)合，或在干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等誘導(dǎo)下經(jīng)過經(jīng)典激活途徑，極化為M1型TAM。M1型TAM分泌因子發(fā)揮先天免疫防御反應(yīng)，殺死腫瘤細(xì)胞。在T輔助細(xì)胞2(Th2)細(xì)胞因子、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4、10、13(IL-4、10、13)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和前

表2 CD163標(biāo)記M2型TAM和CD31標(biāo)記MVD與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between CD163 labeled M2 type TAM and CD31 labeled MVD and clinicopathological features in the cases with breast cancer

表3 138例乳腺癌患者CD163標(biāo)記M2型TAM 與CD31標(biāo)記MVD表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 The correlation between CD163 labeled M2 type TAM and CD31 labeled MVD expression in the cases with breast cancer

圖2 CD163標(biāo)記M2型TAM表達(dá)與 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌預(yù)后關(guān)系Fig.2 The relation of CD163 labeled M2 type TAM and prognosis of breast cancer

圖3 CD31標(biāo)記MVD與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌預(yù)后關(guān)系Fig.3 The relation of CD31 labeled MVD and prognosis of breast cancer

列腺素E2(PGE2)等作用下，TAM通過替代激活途徑極化為M2型TAM，發(fā)揮抗炎作用、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境免疫反應(yīng)、參與基質(zhì)重塑、促進(jìn)血管生成，與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對比癌旁正常組織組，癌組織組微環(huán)境中CD163標(biāo)記M2型TAM和CD31標(biāo)記MVD明顯增高(P<0.05)，表明乳腺癌細(xì)胞可能通過分泌活性物質(zhì)促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞向M2型TAM轉(zhuǎn)化。

乳腺癌相關(guān)研究已明確IL-4可介導(dǎo)TAM極化為M2型TAM，該實(shí)驗(yàn)中腫瘤細(xì)胞合成的集落刺激因子-1(CSF-1)和M2型TAM產(chǎn)生的表皮細(xì)胞生長因子，兩者之間通過相互旁分泌作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲能力[9]。CD163標(biāo)記M2型TAM的數(shù)量與乳腺癌TNM分期、增殖能力、異質(zhì)性相關(guān)[10]。已有研究表明，CD163標(biāo)記M2型TAM與乳腺癌高Ki67和總體生存不良有關(guān)，與高組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER-2表達(dá)無關(guān)，可作為非轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物[11]。而高表達(dá)的CD163標(biāo)記M2型TAM與腫瘤直徑以及雌孕激素受體陰性呈正相關(guān)[12]；CD163標(biāo)記M2型TAM還可與乳腺癌細(xì)胞協(xié)同作用，提升細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)血管生成以及肺轉(zhuǎn)移[13]。本研究提示，CD163標(biāo)記M2型TAM在高組織學(xué)分級、高Ki67增殖指數(shù)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2陽性型的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高表達(dá)(P<0.05)。CD163標(biāo)記M2型TAM在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中明顯高表達(dá)。提示位于血管腔側(cè)的CD163標(biāo)記M2型TAM簇可能通過促進(jìn)膠原纖維形成產(chǎn)生蛋白酶(組織蛋白酶、金屬蛋白酶等)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解基底膜并沿著膠原原纖維向下遷移進(jìn)入血管及脈管系統(tǒng)中，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[9,14]。而在乳腺導(dǎo)管原位癌研究中發(fā)現(xiàn)，CD163標(biāo)記M2型TAM與HER-2陽性有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，CD163標(biāo)記M2型TAM在HER-2陽性型乳腺癌中表達(dá)最高?？赡芘cHER-2陽性型乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子2(CCL-2)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化而上調(diào)整合位點(diǎn)家族成員1(Wnt-1)，下調(diào)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散有關(guān)，因此認(rèn)為HER-2可能通過活化TAM，尤其是M2型TAM，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[16]。提示CD163標(biāo)記M2型TAM介導(dǎo)的微環(huán)境對乳腺癌惡性生物學(xué)行為演進(jìn)產(chǎn)生重要影響。在本組研究中，雖然沒有觀察到CD163標(biāo)記M2型TAM和腫瘤預(yù)后的關(guān)系，這可能與本組入組研究病例少有關(guān)系。

血管生成是腫瘤生長發(fā)展的先決條件，在實(shí)體腫瘤中，血管形成機(jī)制非常復(fù)雜。通常CD31、CD34和Ⅷ因子均已用來評估MVD，CD31比Ⅷ因子標(biāo)記微血管更加可靠。有研究認(rèn)為，CD31標(biāo)記MVD與乳腺癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和總體生存率相關(guān)，是乳腺癌患者預(yù)后不良重要因素[17]。有研究顯示，CD31標(biāo)記MVD與臨床病理特征無關(guān)，并不是評價(jià)乳腺癌的重要預(yù)后因素[18]。盡管乳腺癌中MVD研究結(jié)論不一致，但臨床試驗(yàn)證實(shí)抗血管生成療法對乳腺癌患者有一定的作用，特別是在HER-2陰性患者[17]。本研究提示，CD31標(biāo)記MVD在較大腫瘤直徑、高Ki67增殖指數(shù)和HER-2陽性型及三陰性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高表達(dá)，且在三陰性乳腺癌中高表達(dá)更明顯。這可能是因?yàn)楫?dāng)腫瘤細(xì)胞快速生長時(shí)，腫瘤間質(zhì)不能滿足腫瘤細(xì)胞生長血液供應(yīng)，腫瘤處于缺氧狀態(tài)，缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子，同時(shí)腫瘤細(xì)胞通過糖酵解的方式產(chǎn)能并通過堆積乳酸進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體，VEGF與周圍內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VEGF受體結(jié)合后誘導(dǎo)血管生成[9]。另外，腫瘤干細(xì)胞也可能通過向內(nèi)皮細(xì)胞去分化及分泌血管生成因子促進(jìn)血管生成[19]。本組研究沒有觀察到血管和腫瘤預(yù)后的關(guān)系，可能與本組入組研究病例少，臨床治療方法提高改變了腫瘤自然病程等因素有關(guān)系。

TAM是控制腫瘤血管生成的關(guān)鍵細(xì)胞，M2型TAM轉(zhuǎn)錄譜分析表明，它們在編碼血管生成分子的轉(zhuǎn)錄中高度富集[14]。在乳腺癌、黑色素瘤、肺腺癌及胃癌等人體惡性腫瘤中，TAM浸潤與血管生成呈正相關(guān)[20]。本組研究提示，乳腺癌微環(huán)境中CD163標(biāo)記M2型TAM與CD31標(biāo)記MVD呈正相關(guān)(r=0.180，P<0.05)。這可能是因?yàn)槟[瘤微環(huán)境使TAM主要極化為M2型TAM，從而有效促使血管生長因子表達(dá)升高，在乳腺癌缺氧區(qū)域，TAM特異性的產(chǎn)生VEGF-A，在非缺氧區(qū)域，TAM產(chǎn)生白介素-1β(IL1β)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞VEGF-A釋放，參與腫瘤血管生成。除VEGF外，TAM還可釋放其他促血管生成因子，包括TNFα、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胸苷磷酸化酶(TP)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、腎上腺髓質(zhì)素(ADM)以及信號蛋白4D(Sema4D)等因子。另外，TAM可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動血管生成程序，腫瘤細(xì)胞和TAM在腫瘤微環(huán)境中協(xié)同作用促進(jìn)血管生成因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)血管生成[20]。提示乳腺癌微環(huán)境中，CD163標(biāo)記M2型TAM可直接或是間接促進(jìn)血管生成，影響乳腺癌惡性生物學(xué)行為。