裴美娟，李淑磊，李夢藍(lán)，劉朝陽，宋 娜，王玉飛

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的烈性傳染病，又稱為黑死病，曾發(fā)生幾次歷史大流行，對人類的健康造成巨大的危害。近年來我國時有鼠疫發(fā)生的報道，對人民的健康造成威脅。鼠疫起病急、病程短、病死率高，臨床癥狀常表現(xiàn)為發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、出血、咳嗽，呼吸困難等癥狀，因此進(jìn)行鼠疫的早期診斷和檢測至關(guān)重要。目前，鼠疫耶爾森菌常用的實驗室檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、細(xì)菌分離培養(yǎng)等。但這些常用的實驗室檢測方法存在耗時長、操作復(fù)雜、檢測效率低等缺陷，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種等溫核酸檢測技術(shù)，簡單快速，配合一個便攜式檢測設(shè)備即可實現(xiàn)現(xiàn)場的檢測和判定，這使得在低資源流行環(huán)境下的即時檢測成為可能。因此本試驗建立了一種檢測鼠疫耶爾森菌的熒光RPA方法，可特異靈敏地對鼠疫耶爾森菌進(jìn)行檢測，為鼠疫的現(xiàn)場早期檢測提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料 核酸擴(kuò)增試劑盒(recombinase aided amplification，RAA)(熒光型)購自杭州眾測生物科技有限公司；小提質(zhì)粒試劑盒，感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pUC57購自北京華越洋生物科技有限公司。金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核李斯特菌、紅斑丹毒絲菌、大腸桿菌、沙門氏菌、布魯氏菌、巴氏桿菌、流感嗜血桿菌等常見細(xì)菌的DNA由遼寧省沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病預(yù)防實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 從Genebank中下載鼠疫耶爾森菌的參考序列(CP045258.1)，在BLAST上查找其特異性區(qū)域及保守區(qū)，依據(jù)RPA引物設(shè)計指導(dǎo)，用Primer Premier 6軟件設(shè)計特異性的引物和探針，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DNA模板的制備 BLAST比對后選擇特異性的鼠疫耶爾森菌序列，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成后插入pUC57克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌后構(gòu)建克隆菌株。將克隆菌株培養(yǎng)后采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)粒片段大小計算出拷貝數(shù)，作為RPA試驗?zāi)０濉?/p>

1.2.3 鼠疫耶爾森菌熒光RPA反應(yīng)溫度優(yōu)化 參照RAA核酸擴(kuò)增試劑(熒光型)試劑盒的說明，將25 μl A Buffer、2.0 μl上游引物(10 μm)、2.0 μl下游引物(10 μm)、0.6 μl探針(10 μm)、1 μl DNA模板、16.9 μl水的混合物加入到裝有反應(yīng)干粉的檢測管中，再向檢測管蓋上加入2.5 μl的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10 s。然后放入RPA恒溫擴(kuò)增熒光檢測儀T8(英國TwistDx公司)中，其中鼠疫耶爾森菌DNA為陽性對照，無菌水為陰性對照，同時設(shè)置3個復(fù)孔，在不同溫度反應(yīng)20 min，實驗重復(fù)3次后判定結(jié)果。

1.2.4 鼠疫耶爾森菌熒光RPA特異性檢測 為了確定鼠疫耶爾森菌熒光RPA的特異性，將金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核李斯特菌、紅斑丹毒絲菌的細(xì)菌DNA混合為革蘭陽性菌樣品作為對照組1，將大腸桿菌、沙門氏菌、布魯氏菌、巴氏桿菌、流感嗜血桿菌的DNA混合為革蘭陰性菌的樣品作為對照組2，將無菌ddHO設(shè)置3個復(fù)孔，然后作為樣品進(jìn)行熒光RPA檢測，實驗重復(fù)3次后判定所建立的熒光RPA的特異性。

1.2.5 鼠疫耶爾森菌熒光RPA靈敏性檢測 將質(zhì)粒模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋為10～1000 copies/μl的濃度，然后分別吸取1 μl作為模板配成反應(yīng)體系，將無菌水作為模板設(shè)置陰性對照，同時設(shè)置3個復(fù)孔，放入T8中進(jìn)行檢測，實驗重復(fù)3次后判定所建立的熒光RPA的靈敏性。

1.2.6 模擬樣品的檢測 采用雙盲法，以鼠疫耶爾森菌的質(zhì)粒和大腸桿菌的DNA為材料，人為配制成50份含有不同濃度質(zhì)粒的人工模擬樣品，將質(zhì)粒模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋為1000、100、10 copies/μl的濃度，使用所建立的熒光RPA進(jìn)行檢測，檢測時設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，將檢測結(jié)果與質(zhì)?；旌锨闆r進(jìn)行比對，判定檢測的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 定量數(shù)據(jù)的顯著性分析采用單因素方差分析，以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖片制作。

2 結(jié) 果

2.1 鼠疫耶爾森菌的上下游引物設(shè)計及探針序列 通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，鼠疫耶爾森氏菌的DNA腺嘌呤甲基化酶基因1994590-1994804區(qū)間序列(圖1)特異性強(qiáng)，與其它菌或其它種的耶爾森氏菌存在很大的序列差異，因此將其選擇為RPA檢測的目的基因。依據(jù)熒光RPA引物和探針的設(shè)計規(guī)則，在DNA腺嘌呤甲基化酶基因上設(shè)計了引物和探針(表1、圖1)，并對其特異性進(jìn)行了BLAST比對分析。

圖1 鼠疫耶爾森菌特異性序列及RPA引物和探針位置

表1 試驗使用的RPA引物和探針

2.2 鼠疫耶爾森菌熒光RPA反應(yīng)溫度的優(yōu)化 以鼠疫耶爾森菌DNA質(zhì)粒為模板，以上述RPA反應(yīng)體系進(jìn)行了不同溫度下的RPA反應(yīng)，以獲得最優(yōu)的反應(yīng)溫度。結(jié)果表明反應(yīng)溫度為35 ℃時效果最佳，陽性管(紅色曲線)出現(xiàn)明顯的熒光強(qiáng)度，而陰性管(紫色曲線)只發(fā)生了輕微的熒光強(qiáng)度改變；其他溫度下陰性管出現(xiàn)了較大的熒光強(qiáng)度變化，發(fā)生了假陽性反應(yīng)，同時在39 ℃時陽性的熒光強(qiáng)度也很低，只有1200，反應(yīng)效果差(圖2)。因此，在后面的試驗中均采用35 ℃的反應(yīng)溫度。

圖2 重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增反應(yīng)溫度的優(yōu)化

2.3 鼠疫耶爾森菌熒光RPA試驗特異性 為判定RPA反應(yīng)的特異性，分別以鼠疫耶爾森陽性質(zhì)粒、革蘭陽性菌DNA、革蘭陰性菌DNA為模板，在T8 RPA熒光檢測儀中35 ℃反應(yīng)20 min。結(jié)果表明只有含鼠疫耶爾森基因的質(zhì)粒樣品有明顯的擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，而陰性對照與其他菌株混合組成的革蘭陰性和陽性樣品均無熒光強(qiáng)度變化(圖3)，表明所建立的鼠疫耶爾森菌熒光RPA具有很好的特異性。

圖3 鼠疫耶爾森菌重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增特異性

2.4 鼠疫耶爾森菌熒光RPA靈敏性 分別以1 μl 10～1000 copies/μl濃度的鼠疫耶爾森菌質(zhì)粒為模板配成反應(yīng)體系放入T8檢測儀中進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示鼠疫耶爾森菌質(zhì)粒模板濃度為1000 copies/μl的反應(yīng)管中出現(xiàn)明顯的熒光強(qiáng)度改變，而100 copies/μl的反應(yīng)管中僅出現(xiàn)輕微的熒光強(qiáng)度改變，10 copies/μl以及陰性對照的反應(yīng)管中幾乎沒有熒光強(qiáng)度改變(圖4)，表明所建立的鼠疫耶爾森菌RPA檢測方法具有較好的靈敏性，可檢測到低至100 copies/μl的基因。

圖4 鼠疫耶爾森菌重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增靈敏性

2.5 模擬樣品的檢測 對50份人工模擬樣品的檢測結(jié)果表明，所建立的鼠疫耶爾森菌熒光RPA檢測方法可以從30份摻雜質(zhì)粒的人工模擬樣品中檢出29份陽性，從20份未摻雜質(zhì)粒的樣品中檢出20份陰性，總檢測符合率為98.0%，表現(xiàn)出很好的檢測準(zhǔn)確性。對檢測失敗模擬樣品的分析發(fā)現(xiàn)，其原因是質(zhì)粒摻雜量太少，低于100 copies/μl。

3 討 論

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的一種烈性傳染病，其傳染源主要是嚙齒動物，傳播媒介主要是鼠蚤，在我國屬于甲類傳染病之首。同時鼠疫菌也是生物戰(zhàn)最有可能使用的生物劑之一。雖然當(dāng)前該病流行不嚴(yán)重，但仍時有發(fā)生，2020-07還曾發(fā)生鼠疫病例。鼠疫具有起病急、病程短、傳染性強(qiáng)、病死率高的特點，傳統(tǒng)的鼠疫菌“四步檢驗法”及血球凝集試驗在鼠疫的確診中起著重要的作用，但是存在著操作復(fù)雜、耗時長、安全防護(hù)要求高等缺點。早期診斷可給該病的預(yù)防及治療提供寶貴的時間，因此需要建立敏感快速的診斷方法。然而，以前常用的實驗室檢測方法存在要求高、耗時長、操作復(fù)雜、檢測效率低等缺陷，不適合基層疾控單位和現(xiàn)場，因此，亟需建立一種可現(xiàn)場進(jìn)行的簡便檢測方法。

RPA是一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，它依賴于特定的酶和蛋白組合(重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶)，在常溫下即可發(fā)生反應(yīng)，5～20 min即可獲得結(jié)果，可簡單快速地進(jìn)行病原基因的擴(kuò)增，這使得在低資源流行環(huán)境下進(jìn)行即時診斷成為可能?，F(xiàn)在已有RPA應(yīng)用于多種傳染性疾病檢測的報道，然而，尚無RPA應(yīng)用于鼠疫耶爾森菌檢測的報道。

為建立鼠疫耶爾森菌的熒光RPA檢測方法，首先對鼠疫耶爾森菌的基因序列進(jìn)行了BLAST分析，找到特異性的DNA腺嘌呤甲基化酶基因序列。隨后進(jìn)行了擴(kuò)增溫度的優(yōu)化，獲得了最佳的擴(kuò)增溫度。在此溫度下進(jìn)行了靈敏性、特異性和模擬樣品的檢測試驗，表明所建立的熒光RPA方法可檢出低至100個拷貝的基因，且在模擬樣本中檢出率高，與常見細(xì)菌核酸不發(fā)生交叉反應(yīng)，快速準(zhǔn)確。雖然本實驗是建立在模擬樣本的基礎(chǔ)上進(jìn)行的驗證，但由于其便捷性以及高特異性和靈敏性，在鼠疫菌快速檢測方面展現(xiàn)出了很好的應(yīng)用前景，為現(xiàn)場檢測提供新思路。