張海鵬,李玉瓊,劉正祥,段興德,樊 榮,浦恩念,洪 梅,王 鵬,3,邵宗體,3

耶爾森菌屬包含鼠疫耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌這3種對(duì)人類致病的菌種[1]。鼠疫是一種對(duì)人類危害極為嚴(yán)重的自然疫源性疾病,歷史上曾發(fā)生過(guò)3次世界范圍內(nèi)的大流行,導(dǎo)致1億多人死亡,其中第三次大流行起源于中國(guó)云南[2-3]。2013年至今,甘肅、云南等地相繼發(fā)生人間鼠疫,目前新的鼠疫自然疫源地和染疫動(dòng)物不斷被發(fā)現(xiàn),部分省區(qū)鼠疫疫源地疫情回升[4],云南省鼠疫疫情仍舊是一個(gè)值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌作為腸道致病菌危害著人類的健康,世界范圍內(nèi)流行,除能引起胃腸道疾病以外,還能引起全身多個(gè)系統(tǒng)及器官的癥狀[5]。中國(guó)在20世紀(jì)80年代曾有過(guò)兩次小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的流行[6],而云南省是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的高發(fā)區(qū)。假結(jié)核耶爾森菌在我國(guó)尚沒(méi)有暴發(fā)疫情的報(bào)道。云南金沙江流域地理位置特殊,生態(tài)環(huán)境復(fù)雜,且與其接壤的四川省鼠疫流行態(tài)勢(shì)同樣嚴(yán)峻,加之金沙江流域不斷修建大型梯級(jí)電站,可導(dǎo)致局部生態(tài)環(huán)境改變,容易誘發(fā)鼠疫等傳染病的暴發(fā)和流行。然而,近年來(lái)尚未對(duì)云南省金沙江中下游流域開(kāi)展過(guò)關(guān)于致病性耶爾森菌的調(diào)查研究,流域范圍大部分地區(qū)鼠疫監(jiān)測(cè)防控不容樂(lè)觀,長(zhǎng)期靜息或不明的疫源地一旦活躍出現(xiàn)疫情,可能由于準(zhǔn)備不足或缺乏鼠疫防治經(jīng)驗(yàn),造成傳播流行。本研究選取云南省金沙江中下游流域部分地區(qū)進(jìn)行標(biāo)本采集,分析3種致病耶爾森菌在該流域的分布和流行情況。調(diào)查3種對(duì)人致病性耶爾森菌的分布將有助于探討鼠疫菌在自然界長(zhǎng)期保存及變化的機(jī)理,為制訂3種致病菌防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 PCR儀(SENSO Lab Cycler PCR德國(guó))、生物安全柜(Nu Air Lab GARPE SclassⅡ美國(guó))、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 54美國(guó))、電泳儀(Hoefer PS3008美國(guó))、耶爾森選擇培養(yǎng)基(CIN,OXIOD英國(guó))、改良磷酸鹽緩沖溶液(Sigma-Aldrich FULKA美國(guó))、瓊脂糖凝膠(Biowest Agarose西班牙)、PcR試劑(上海生工)、DNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 2018年至2020年從云南省昭通市永善縣、綏江縣、水富縣,昆明市祿勸縣以及楚雄州元謀縣采集鼠腸回盲段、犬肛門拭子標(biāo)本,及時(shí)放入10 mL改良PBS增菌液中低溫保存運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室放入4 ℃冰箱冷增菌21 d備檢。

1.2.2 樣本PCR初篩 按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取標(biāo)本增菌液的DNA,對(duì)提取的DNA進(jìn)行caf1、foxA、ail及inv基因的PCR初篩[7],擴(kuò)增結(jié)束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀觀察結(jié)果。結(jié)果判讀:caf1基因陽(yáng)性為鼠疫耶爾森菌,foxA基因陽(yáng)性為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,inv基因陽(yáng)性為假結(jié)核耶爾森菌。ail基因陽(yáng)性為致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

1.2.3 可疑菌株分離培養(yǎng) 將PCR初篩陽(yáng)性的冷增菌液接種在耶爾森菌選擇培養(yǎng)基CIN瓊脂平板上,經(jīng)25 ℃、24 h培養(yǎng)后,觀察并挑選可疑單菌落做進(jìn)一步鑒定。

1.2.4 疑似陽(yáng)性菌落PCR篩查 挑取適量上述培養(yǎng)出的可疑單菌落對(duì)其進(jìn)行caf1、foxA、ail及inv基因的菌落PCR鑒定,陽(yáng)性者進(jìn)行分離純化。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分析各地區(qū)致病性耶爾森菌的攜帶率差異。用卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本采集結(jié)果 共采集1 631份樣本,其中昭通綏江縣153份,水富縣229份,永善縣407份,昆明祿勸縣381份,楚雄元謀縣461份。詳見(jiàn)表1。

表2 各地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分離情況Tab.2 Isolation of Yersinia enterocolitica by region

2.2 菌株分離結(jié)果 共分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌38株,分離率為2.33%,其中永善縣分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌17株,分離率為4.18%;水富縣分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌8株,分離率為3.49%;祿勸縣分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌8株,分離率為2.10%;元謀縣分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5株,分離率為1.08%。分離到假結(jié)核耶爾森菌1株,分離率為0.06%;未分離到鼠疫耶爾森菌。詳見(jiàn)表1。

2.3 3種致病耶爾森菌統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.3.1 各地區(qū)3種致病性耶爾森菌的分離情況 經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析,云南省金沙江中下游流域5個(gè)縣中,除昭通綏江縣未分離到3種致病性耶爾森菌外,其余4個(gè)地區(qū)的3種致病耶爾森氏菌總分離率不完全相同(χ2=10.457 ,P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表示4個(gè)縣3種致病耶爾森菌分離率不全相同,且昭通永善縣的3種致病耶爾森氏菌總分離率大于其余地區(qū)。

2.3.2 各地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分離情況 經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析,云南省金沙江中下游流域5個(gè)縣中,除昭通綏江縣未分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌外,其余4個(gè)地區(qū)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率也不完全相同(χ2=9.447,P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表示4個(gè)縣小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率不全相同,且昭通永善縣的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分離率大于其余地區(qū)。

2.3.3 鼠類和犬類小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分布情況 共采集樣本1 631份,鼠回盲段樣本985份、犬類肛拭子646份。其中鼠回盲段樣本中分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌24份,分離率為2.44%。犬類肛拭子樣本中分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌14份,分離率為2.17%。經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析,兩宿主中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.124,P>0.05),即不能認(rèn)為鼠類與犬類小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率不同。

3 討 論

3.1 云南省金沙江中下游流域未發(fā)現(xiàn)鼠疫菌線索 云南省鼠疫疫區(qū)范圍廣泛,野鼠鼠疫疫源地主要集中在大理市與麗江市,家鼠鼠疫疫源地主要在云南省中南部地區(qū),金沙江流域在建國(guó)之前曾有鼠疫流行的記載,但最近幾十年并沒(méi)有過(guò)鼠疫流行,由于與之毗鄰的四川省鼠疫疫情時(shí)有發(fā)生,并且在鼠疫菌分子流行病學(xué)地理分布上,呈現(xiàn)青藏高原到四川再到云南的趨勢(shì),所以在金沙江流域進(jìn)行鼠疫線索的調(diào)查很有必要,本次調(diào)查中只發(fā)現(xiàn)與鼠疫菌近源的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌,未發(fā)現(xiàn)鼠疫菌基因陽(yáng)性樣本,也未分離到鼠疫菌。需要繼續(xù)對(duì)該流域進(jìn)行監(jiān)測(cè),預(yù)警鼠疫的發(fā)生與流行。

3.2 云南省金沙江中下游流域存在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分布 云南省金沙江中下游流域5個(gè)縣共采集1 631份樣本,共分離到38株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,分離率為2.33%,其中昭通水富縣分離率為3.49%,昭通永善縣分離率為4.18%,昆明祿勸縣分離率為2.10%,楚雄元謀縣分離率為1.08%,這4個(gè)地區(qū)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率不完全相同,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且昭通永善縣分離率最高。2013年至2014年間,對(duì)麗江家犬進(jìn)行3種致病耶爾森菌調(diào)查表明,小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率0.8%[8]、云南省10個(gè)家鼠鼠疫疫源縣犬肛門拭子中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率為1.64%[9]、梁河縣家鼠鼠疫疫源地捕獲的鼠的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率為0.4%(2/533)[10],即云南各地小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分布各不相同,且差異較大,金沙江中下游流域家犬與鼠中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率相比云南省其他地區(qū)而言處于較高水平。金沙江中下游流域鼠類小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率與犬類小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不能認(rèn)為鼠類與犬類小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率不同。此外,本次實(shí)驗(yàn)分離到的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均為非致病菌,表明該地區(qū)鼠間、犬間尚未形成小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的流行。

3.3 云南省首次自鼠疫指示動(dòng)物犬中分離到假結(jié)核耶爾森菌 假結(jié)核耶爾森菌廣泛分布于世界各地,在已發(fā)現(xiàn)該菌的大多數(shù)國(guó)家,假結(jié)核耶爾森菌的感染率一般都稍低于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的感染率[11]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)該菌的研究處于起步階段,于恩庶教授首先對(duì)假結(jié)核耶爾森菌進(jìn)行了系統(tǒng)全面的論述,并證實(shí)了假結(jié)核耶爾森菌在福建省內(nèi)有廣泛流行,人畜均有感染[12]。假結(jié)核耶爾森菌的感染率雖低于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,但后者對(duì)人體的危害更大。假結(jié)核耶爾森菌具有侵襲力,有明顯的淋巴嗜性,該菌經(jīng)口進(jìn)入人體消化道,移行至回腸,發(fā)生病理?yè)p害。部分患者體內(nèi)細(xì)菌向深部播散入血, 移行到肝、脾,發(fā)生全身?yè)p害[13]。假結(jié)核耶爾森菌分布非常廣泛,昆蟲、鳥類、哺乳動(dòng)物均可成為該菌的宿主。且廣泛分布于各種水體及土壤等環(huán)境中,在各種清潔度的水源都曾分離到該菌[14]。人類由于接觸被感染動(dòng)物糞便污染的食物或直接接觸造成感染[15]。本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)在云南省各地區(qū)進(jìn)行致病性耶爾森菌研究10年之久,昭通永善縣犬中分離到的假結(jié)核耶爾森菌是首次發(fā)現(xiàn),下一步應(yīng)開(kāi)展對(duì)該菌的進(jìn)一步研究,以判斷其致病性強(qiáng)弱,是否有引起當(dāng)?shù)亓餍械内厔?shì),同時(shí)也要求人們?cè)谏钪凶⒅仫嬍承l(wèi)生,加強(qiáng)健康教育。當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該菌的監(jiān)測(cè),避免感染的發(fā)生。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:張海鵬,李玉瓊,劉正祥,等.云南省金沙江中下游流域致病性耶爾森菌調(diào)查研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):822-825. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.090