申玉潔 李祿全 魏璐 張先紅 趙文靜 劉曉晨 吳利平

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科/國家兒童健康與疾病國家臨床研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014）

腸道是人類微生物種群最多、最復(fù)雜的部位，在成人腸道內(nèi)有400 多種細菌，總數(shù)達1×1014個。腸道菌群對宿主整個生命周期的健康發(fā)揮重要作用，通過對腸道菌群動態(tài)變化的檢測，可以反映出宿主發(fā)育的軌跡。研究表明，腸道菌群與新生兒發(fā)育和免疫系統(tǒng)的形成密切相關(guān)，生命早期腸道菌群的結(jié)構(gòu)、相對豐富度及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）影響兒童日后患疾病的概率［1］。因此，監(jiān)測腸道菌群在生命早期的變化具有重要的臨床意義。而新生兒生后腸道菌群定植受多種因素影響，如出生方式、喂養(yǎng)方式、胎齡和抗生素應(yīng)用等，尤其是喂養(yǎng)方式，其中腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間的早晚直接影響了新生兒期腸道菌群的建立［2］。極低出生體重兒（very low birth weight infant，VLBWI）由于消化系統(tǒng)未成熟，常需靜脈營養(yǎng)支持以滿足基本營養(yǎng)需要，但也容易發(fā)生院內(nèi)感染和由深靜脈置管引起的并發(fā)癥［3］。故指南推薦VLBWI 營養(yǎng)策略是在保證安全的前提下，盡早建立腸內(nèi)營養(yǎng)，盡快達到足量全腸內(nèi)喂養(yǎng)［4］。然而，目前VLBWI 腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間存在爭議，且開始時間“早”或“晚”的定義尚不統(tǒng)一，過早易導(dǎo)致喂養(yǎng)不耐受、壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）的發(fā)生，而延遲喂養(yǎng)又可能影響胃腸道的發(fā)育［5-6］。故本研究通過前瞻性地觀察VLBWI 腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間，探討不同腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響，為尋找適宜的VLBWI 腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科2020年6～12月收治的VLBWI為研究對象。納入標準：（1）胎齡＜30周；（2）出生體重＜1 500 g；（3）日齡＜24 h；（4）純母乳喂養(yǎng)。排除標準：（1）住院期間死亡或放棄治療者；（2）入院診斷為NEC（Bell 分期Ⅱ期及以上）、食物蛋白過敏性腸炎、乳糖不耐受等能夠影響腸道菌群的消化道疾病者；（3）合并先天性消化道畸形者；（4）未完成糞便菌群及SCFAs 測定者；（5）不愿參加本研究者。共納入29 例患兒，根據(jù)生后腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間（開奶時間）不同分為＜24 h 組（n=15）和24～72 h組（n=14）。

本研究通過由我院倫理委員會批準（No.2021-67），并簽署了家屬知情同意書。

1.2 腸內(nèi)及腸外營養(yǎng)方案

參照 2015 年加拿大 VLBWI 喂養(yǎng)指南［4］，生后24 h內(nèi)開始靜脈營養(yǎng)支持，并根據(jù)患兒病情和喂養(yǎng)是否耐受擇期進行腸內(nèi)營養(yǎng)。（1）腸內(nèi)營養(yǎng)：采用母乳喂養(yǎng)、經(jīng)管飼喂養(yǎng)；間歇喂養(yǎng)每3 h 1次；開始喂養(yǎng)量10～20 mL/(kg·d)，緩慢增加，增加速度15～20 mL/(kg·d)，直至達到全腸內(nèi)營養(yǎng) 150 mL/(kg·d)。病情穩(wěn)定、無喂養(yǎng)禁忌證者，生后24 h 內(nèi)開始喂養(yǎng)，通過胃內(nèi)回抽殘余奶量的方式判斷消化吸收情況，若3 h后胃殘余量超過前1次喂養(yǎng)量的50%，并伴有嘔吐和/或腹脹，則視為喂養(yǎng)不耐受，予暫禁食，次日9點再試喂1次；反之為喂養(yǎng)耐受，當(dāng)天即開始腸內(nèi)營養(yǎng)［7］。（2）靜脈營養(yǎng)：第1天給予氨 基 酸 ， 起 始 劑 量 為 1.0～1.5 g/(kg·d)， 按 0.5～1 g/(kg·d)增加，直至總量達到3.5～4.0 g/(kg·d)；第2 天開始給予脂肪乳劑，起始劑量為1.0 g/(kg·d)，按0.5～1 g/(kg·d)增加，直至總量達到3 g/(kg·d)。

1.3 糞便標本收集及保存

所有納入本研究的患兒均于生后第2 周、第4周用無菌糞便收集器采集新鮮糞便標本后，每管稱量250 mg糞便標本分裝至1.5 mL 消毒去酶EP管中，凍存于-80℃冰箱備用。

1.4 糞便標本DNA提取、PCR擴增和高通量測序

用 QIAamp FAST DNA Stool Mini-Kit （德國Qiagen）提取糞便菌群基因組DNA。在1%的瓊脂糖凝膠上檢測DNA 提取物，并用分光光度計（NanoDrop 2000 UV-vis，Thermo Scientific，美國）評估DNA 的濃度和純度。用引物338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） ， 806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴增腸道細菌16S rDNA 基因的V3～V4 高變區(qū)。擴增步驟如下：初始變性（95℃、3 min），變性（95°C持續(xù)30 s），退火 （55°C 持續(xù)30 s） 和延伸 （72°C 持續(xù)45 s），共27個循環(huán)，再進行延伸（72°C持續(xù)10 min）。凝膠電泳分離產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 （Axygen BioSciences） 回 收 ， 并 用 Quantus Fluorometer（Promega，USA）定量。創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫，并在與Illumina MiSeq相關(guān)的平臺上對其進行排序。

1.5 糞便標本生物信息分析

使用UPARSE 7.1 版將處理后的序列分為可操作的生物分類單位（operational taxonomic units，OTU），以97%的相似性閾值與OTU進行生物信息學(xué)聚類分析，對數(shù)據(jù)進行Alpha多樣性分析（腸道菌落中物種的豐富度、多樣性分別用Chao 指數(shù)值和Shannon指數(shù)值來體現(xiàn)）和群落組成分析。

1.6 糞便標本SCFAs測定

乙酸乙酯依次加入8種SCFAs標品和2-乙基丁酸制得8 種SCFAs 的混標儲備溶液和內(nèi)標儲備液。兩者混合后用乙酸乙酯稀釋成8個不同濃度的工作液 。 適 量 樣 本 研 磨 （3 min、 2 次 ）、 冰 ?。?0 min）、靜置 （4℃、30 min）、離心 （4℃、15 min），萃取后冰浴 （10 min），13 000 g 離心（4℃、10 min）后進行氣相色譜-質(zhì)譜檢測分析。采用Masshunter定量軟件對目標SCFAs進行自動識別和積分，并輔助人工檢查。通過標準曲線計算并換算出樣品中SCFAs的實際含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］ 表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，組內(nèi)比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒一般資料

共收治60 例VLBWI，其中住院期間死亡和放棄者7例，先天性消化道畸形9例，未完成腸道菌群和SCFAs 測定者5 例，不愿意參與本研究者10例，最終納入29例VLBWI。生后開奶時間＜24 h組15 例，24～72 h 組 14 例，所有患兒均在 3 d 內(nèi)成功開奶。2 組VLBWI 性別、出生情況、母孕期情況、呼吸機使用時間和藥物使用情況、住院時間及并發(fā)癥等指標比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組不同腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間VLBWI臨床指標對比

表1（續(xù)）

2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析

開奶時間＜24 h 組生后第4 周Chao 指數(shù)較第2周下降（P＜0.05），Shannon指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。24～72 h 組生后第 2 周和第 4 周 Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。開奶時間＜24 h組與24～72 h組比較，生后第2周和第4周Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間VLBWI糞便的菌群Alpha多樣性分析

2.3 腸道菌群豐富度比較

在門水平上，開奶時間＜24 h 組生后第4 周變形菌門減少，厚壁菌門增加（P＜0.05）；在屬水平上，不動桿菌屬減少，韋榮球菌屬、梭菌屬增加（P＜0.05）。24～72 h 組生后第 4 周腸道菌群在門、屬水平上變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 腸道菌群豐富度組內(nèi)比較

開奶時間＜24 h 組與24～72 h 組比較，生后第2周和第4周主要菌群在門、屬水平上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 腸道菌群豐富度組間比較

2.4 SCFAs測定

開奶時間＜24 h組和24～72 h組第4周SCFAs 總量較第2 周均升高（P＜0.05）。第4 周，開奶時間＜24 h 組乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、異己酸均升高（P＜0.05），24～72 h組丙酸、丁酸、戊酸升高（P＜0.05）。生后第4 周開奶時間＜24 h 組丙酸高于 24～72 h 組 （P＜0.05），SCFAs 總量及其他各SCFAs含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同腸內(nèi)營養(yǎng)開始時間VLBWI糞便的SCFAs含量分析 ［M（P25，P75），μg/g］

3 討論

腸道菌群的組成與NEC、喂養(yǎng)不耐受等新生兒腸道疾病的發(fā)生存在明顯相關(guān)性，而開奶時間的早晚直接影響了VLBWI 早期腸道菌群的建立。本研究發(fā)現(xiàn)不同開奶時間對腸道代謝產(chǎn)物SCFAs水平產(chǎn)生較大影響，而對腸道菌群的多樣性、豐富度的影響則不明顯。

VLBWI 由于離開母體時胎齡不足，胃腸道運動發(fā)育不成熟，導(dǎo)致VLBWI 不能早期開始腸內(nèi)營養(yǎng)或出現(xiàn)喂養(yǎng)不耐受。動物實驗顯示，小鼠完全腸外營養(yǎng)禁食3 d后，會出現(xiàn)腸絨毛變平、腸黏膜萎縮等癥狀，提示僅進行腸外營養(yǎng)支持對消化功能發(fā)育有一定影響［8］。國外研究已證實，VLBWI開奶時間越晚，其喂養(yǎng)不耐受發(fā)生率越高，而早期經(jīng)口喂養(yǎng)可使VLBWI 腸道較早得到食物有效刺激，從而使其腸道蠕動活動增多，增加機體內(nèi)腸道激素分泌，有利于胃腸動力學(xué)改變，促使腸道黏膜的上皮細胞發(fā)育和成熟，故早期喂養(yǎng)策略對VLBWI 而言不僅是營養(yǎng)支持更是治療手段［9］。本研究中，VLBWI 生后24 h 內(nèi)開始腸內(nèi)營養(yǎng)的15 例（占52%），其余14 例均在72 h 內(nèi)成功實現(xiàn)腸內(nèi)喂養(yǎng)，總體開奶時間早于于新穎等［10］的研究，其原因可能是喂養(yǎng)乳品不同。本研究采用母乳開奶，相比早產(chǎn)兒配方奶，母乳不僅可為VLBWI 提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，保證其生長發(fā)育，且其中所含的高比例的乳清蛋白和低含量的脂肪、乳糖量，更有利于VLBWI吸收和加速胃排空。

新生兒腸道菌群的定植最早可追溯至宮內(nèi)時期。研究發(fā)現(xiàn)，在宮內(nèi)時新生兒少量的菌群定植可能來源于母體子宮內(nèi)胎盤和羊水［11］；在分娩時，分娩方式的不同（如順產(chǎn)/剖宮產(chǎn)）則明顯影響不同微生物菌群在新生兒的定植，有研究報道，與剖宮產(chǎn)新生兒相比，順產(chǎn)新生兒經(jīng)過產(chǎn)道時更有機會接觸更多的共生菌群，從而有益于優(yōu)勢菌群的定植［12］；在出生后，不同的生活環(huán)境及抗生素的使用則明顯改變新生兒微生物菌群的豐富度和多樣性［13］。本研究中，與開奶時間＜24 h 組相比，24～72 h 組 VLBWI 在生后第 2 周、第 4 周時間點的腸道菌群豐富度和多樣性指標均無差異，這可能有幾方面的原因。第一，開奶時間＜24 h 組和24～72 h 組的順產(chǎn)比例不同（53% vs 29%）。雖然2 組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但后者順產(chǎn)比例相對較低，可能會影響2組間腸道菌群的組成。第二，采集時間點單一。由于影響腸道菌群組成的因素眾多，僅在單一的時間點（生后第2周、第4周）采集樣本可能會使結(jié)果產(chǎn)生偏倚。第三，樣本量局限。由于不同個體的腸道菌群分布差異較大，尤其在人群樣本中更為明顯，故在小樣本調(diào)查研究時，可能導(dǎo)致出現(xiàn)2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

SCFAs大多是未經(jīng)吸收利用的膳食纖維被大腸的腸道菌群發(fā)酵而生成的，其中丁酸、乙酸、丙酸是主要SCFAs，占腸腔內(nèi)產(chǎn)生SCFAs 85%以上［14］。在本研究中，與24～72 h組相比，開奶時間＜24 h 組VLBWI 在生后第4 周時的丙酸水平明顯偏高，其他SCFAs 水平則無明顯改變。許多研究已經(jīng)報道，不同SCFAs 在維持腸道穩(wěn)態(tài)、糖脂代謝調(diào)節(jié)、神經(jīng)認知調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等方面扮演重要的作用［14-16］，而其中大多數(shù)研究關(guān)注丁酸鹽，再較少延伸至乙酸鹽，丙酸在生理和病理方面的潛在作用一直被低估，相關(guān)文獻較少?，F(xiàn)有證據(jù)表明，丙酸在維持腸道穩(wěn)態(tài)、免疫調(diào)節(jié)等方面起重要的作用，如丙酸可增加腸道緊密連接蛋白如ZO-1、occludin 的含量以增強了腸道上皮屏障，減少了腸道炎癥及氧化應(yīng)激［17-18］，且丙酸可通過腸-腦軸對抗中樞和腸道神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥激活［19］；此外，丙酸還具有調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫的重要生理功能，抑制組蛋白去乙?；傅幕钚裕黾诱{(diào)節(jié)T細胞的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)T 細胞對減少腸道炎癥至關(guān)重要［20］，且減少了腸道γδT 細胞產(chǎn)生白細胞介素-17 和白細胞介素-22［21］，促進結(jié)腸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在動物實驗中，補充丙酸可激活Nrf2 介導(dǎo)的抗炎和抗氧化途徑，保護新生小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞免受由脂多糖引起的肺泡簡單化和異常血管生成，以預(yù)防支氣管肺發(fā)育不良［22］。而本研究中2 組患兒均存活出院，且住院時間及腹瀉、腹脹、便秘等相關(guān)指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮樣本量小，觀察時間較短，仍需后期隨訪等。

本研究有一定的局限性。本研究涉及的取樣時間點及樣本量較少，而新生兒出生后由于環(huán)境的突然改變導(dǎo)致的生理指標變化較大，使得本研究的結(jié)論有一定的片面性；另外，由于只檢測腸道SCFAs 的含量而不是直接檢測血液及組織中SCFAs的含量，導(dǎo)致SCFAs解釋糖脂類調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等疾病的相關(guān)性較低。然而，該指標用于評價由腸道菌群失調(diào)、腸道SCFAs 紊亂導(dǎo)致的腸道疾病時則有一定的參考價值。

因此，與腸道營養(yǎng)開始時間較晚相比，在24 h內(nèi)開始腸道營養(yǎng)可增加VLBWI 第4 周時腸道丙酸水平，而對其他SCFAs 水平及腸道微生物分布則可能沒有明顯影響，這為解釋早期腸內(nèi)營養(yǎng)患兒的預(yù)后總體較好提供可能的依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。