吳 佳

鏈霉菌AJ56是分離自纈草根際部位的放線菌。纈草作為一種重要的藥用植物資源，富含多種化學(xué)成分,分別有揮發(fā)油、黃酮、生物堿、環(huán)烯醚萜、木脂素等[1-5]。豐富的化學(xué)成分使得纈草具有多種藥理作用[6]。前期研究表明，鏈霉菌AJ56含有鹵代酶類(lèi)抗生素生物合成基因。在高通量藥物篩選中，一般的化合物都具有鹵族元素[7],相當(dāng)一部分的次生代謝鹵化物具有抗菌和抗癌等生物活性，具有較高的藥用活性價(jià)值[8]，如硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin)、萬(wàn)古霉素(Vancomycin)、金霉素(Chlorotetracyline)等具有顯著的抗菌活性，抗腫瘤藥物蝴蝶霉素(Rebeccamycin)，刺孢霉素(Calicheamycin)以及抗HIV藥物(ChloropeptinⅠ，Ambigol A)等[9]。因不同的菌含有不同的酶系統(tǒng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解能力不同，因而代謝產(chǎn)物各有不同，本研究圍繞纈草根際部位鏈霉菌AJ56的生理生化特性展開(kāi)研究，用生化試驗(yàn)方法檢測(cè)鏈霉菌對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，為進(jìn)一步挖掘該菌株的生防應(yīng)用價(jià)值及發(fā)現(xiàn)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株AJ56是從纈草根際分離的含鹵代酶類(lèi)抗生素基因的鏈霉菌。

1.2 方法

1.2.1菌株AJ56的形態(tài)特征觀察 本研究以鏈霉菌AJ56為材料，對(duì)其進(jìn)行蓋玻片爬片法培養(yǎng)，在場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察其形態(tài)特征。首先選用6種放線菌培養(yǎng)基(高氏一號(hào)，GSY，2×CMY，YMS，ISP4和MS)培養(yǎng)菌株AJ56，觀察其在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況；再選擇最適培養(yǎng)基對(duì)菌株AJ56進(jìn)行劃線(單條線)培養(yǎng)，1 d后在培養(yǎng)基劃線處插片；待其長(zhǎng)出孢子后開(kāi)始處理菌株，經(jīng)2.5%的戊二醛處理，4 ℃過(guò)夜固定后對(duì)菌株標(biāo)本進(jìn)行漂洗及脫水處理，經(jīng)乙酸異戊酯溶液處理，干燥后在場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.2.2菌株AJ56的生理生化試驗(yàn) (1)菌株AJ56的碳氮源利用試驗(yàn)：本研究選擇的碳源包括乙酸鈉、檸檬酸鈉、甘露醇、肌醇、葡萄糖、木糖、甘油、山梨醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和草酸鈉；氮源包括色氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸、纈氨酸、酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同碳源，使終濃度為1%。添加氮源終濃度為0.5%。觀察菌株AJ56在不同碳源和不同氮源下的生長(zhǎng)情況。(2)菌株AJ56的其他生理生化試驗(yàn)：①溫度耐受試驗(yàn)，分別在4 ℃、28 ℃、37 ℃條件下培養(yǎng)觀察菌株AJ56的生長(zhǎng)狀況。②鹽耐受試驗(yàn)，TSB培養(yǎng)基中按濃度梯度分別加入0、1%、3%、5%、7%、10%的NaCl(質(zhì)量體積比)，將菌株AJ56的孢子分別接種到不同NaCl濃度的TSB培養(yǎng)基中，平均2 d觀察其生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)15 d后結(jié)束觀察。③明膠液化，將菌株AJ56接種至明膠培養(yǎng)基中，同時(shí)取一支未接菌的作對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)14 d，每2 d觀察1次明膠液化程度。④淀粉水解試驗(yàn)，取菌液點(diǎn)種(約4～6個(gè))于培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)4～7 d。待菌落長(zhǎng)成后滴加路哥氏碘液，觀察菌落周?chē)欠癞a(chǎn)生透明圈。⑤纖維素分解試驗(yàn)，將菌株AJ56分別在含纖維素與不含纖維素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(28 ℃培養(yǎng)4～7 d)觀察菌的周?chē)欠裼袝灜h(huán)。⑥牛奶凝固與胨化，將菌株AJ56轉(zhuǎn)接到脫脂牛奶培養(yǎng)基中(28 ℃培養(yǎng))共培養(yǎng)14 d，每2 d觀察記錄1次牛奶是否形成凝塊并分解。

2 結(jié)果

2.1 菌株AJ56的形態(tài)觀察

經(jīng)6種放線菌培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株AJ56(見(jiàn)圖1)發(fā)現(xiàn)其在高氏一號(hào)生長(zhǎng)較好，菌絲呈白黃色，孢子產(chǎn)量豐富。經(jīng)插片培養(yǎng)處理，在場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡S-4800下觀察，由于培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，基絲基本處于斷裂狀態(tài)，無(wú)隔。菌株AJ56的基絲直徑約0.5～0.8 μm，孢子呈短桿狀，長(zhǎng)約1.4～1.5 μm，表面結(jié)構(gòu)為圓頭形刺狀凸起，見(jiàn)圖2。

圖1 菌株AJ56在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 AJ56孢子掃描電鏡圖

2.2 菌株AJ56的生理生化試驗(yàn)

2.2.1菌株AJ56的碳氮源利用試驗(yàn) 本研究選用13種常見(jiàn)的碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株AJ56，發(fā)現(xiàn)其可以利用多種碳源，但不能將草酸鈉作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，見(jiàn)表1。選擇11種常見(jiàn)的氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)多種氮源可以滿足其生長(zhǎng)，但是天冬氨酸和谷氨酸不能作為唯一氮源滿足菌株AJ56的生長(zhǎng)，見(jiàn)表2。

表1 菌株AJ56碳源利用試驗(yàn)結(jié)果

表2 菌株AJ56氮源利用試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2菌株AJ56的其他生理生化試驗(yàn) 其他生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)菌株AJ56發(fā)現(xiàn)：其在3種溫度下都能生長(zhǎng)，但是4 ℃和37 ℃條件下生長(zhǎng)較慢；該菌株可在含有7% NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，耐鹽程度相對(duì)較強(qiáng)；并且可以使明膠液化，產(chǎn)生淀粉酶將淀粉分解以及將纖維素降解，但是不能將牛奶胨化，說(shuō)明該菌株不產(chǎn)生凝乳酶和蛋白酶。見(jiàn)表3。

表3 菌株AJ56其他生理生化試驗(yàn)特征

3 結(jié)論

鏈霉菌屬(Streptomyces)放線菌是一類(lèi)高G+C含量的革蘭氏陽(yáng)性菌，因能產(chǎn)生多種重要的天然化合物被人們廣泛關(guān)注。目前己知的抗生素大多數(shù)是由鏈霉菌產(chǎn)生，約占已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗生素總數(shù)的2/3[10]。這些化合物中有抗細(xì)菌、抗真菌或其他活性的，例如由鏈霉菌ATCC14,046產(chǎn)生的具有抗分支桿菌作用的羅非霉素、由灰色鏈霉菌產(chǎn)生的廣譜抗生素-鏈霉素等,還有其他許多免疫抑制劑、抗癌藥物、抗蟲(chóng)劑及其他胞外水解酶等[11]。

本研究圍繞鏈霉菌AJ56生理生化特性展開(kāi)研究，以便初步了解該菌株的酶系統(tǒng)以及代謝能力。通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)菌株的菌體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)該菌株的基絲直徑約0.5～0.8 μm，菌落偏黃色，孢子呈短桿狀，長(zhǎng)約1.4～1.5 μm，表面結(jié)構(gòu)為圓頭形刺狀凸起。再研究其對(duì)不同碳氮源的利用效果，發(fā)現(xiàn)菌株AJ56能利用檸檬酸鈉、甘露醇、肌醇、葡萄糖、木糖、甘油、山梨醇、海藻糖、乳糖、麥芽糖和乙酸鈉，不能利用草酸鈉作為唯一碳源?？梢岳蒙彼帷⒔z氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸、纈氨酸、酪氨酸和精氨酸作為唯一氮源，但不能利用天冬氨酸和谷氨酸作為唯一氮源。菌株AJ56可在含有7% NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，耐鹽程度相對(duì)較強(qiáng)，并且可以使明膠液化，產(chǎn)生淀粉酶將淀粉水解，同時(shí)具有降解纖維素的能力，但不能產(chǎn)生凝乳酶和蛋白酶?？傊?，通過(guò)生理生化特性研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌AJ56具有較好的生理生化特性，便于后期開(kāi)展該菌株的生防機(jī)理研究及相關(guān)的鹵代酶類(lèi)基因功能研究。