馬聰聰， 羅澤華， 蔡斌， 劉好寶*， 王云山， 馬銳， 顧金剛*

（1.中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，?？?570105；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；3.中國科學院過程工程研究所，北京 100190）

高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)多分布于土壤，產(chǎn)淀粉酶和堿性蛋白酶[1]。在生長發(fā)育后期，芽孢桿菌的細胞質高度脫水可形成圓形或橢圓形的休眠體，即芽孢[2]。芽孢具有耐高溫、耐高壓、耐干燥、耐酸堿、耐有機溶劑等特性，廣泛應用于醫(yī)藥、種植業(yè)、畜牧業(yè)等領域[3-4]。產(chǎn)芽孢不穩(wěn)定、芽孢率低、芽孢量少等會影響芽孢桿菌的應用[5]。碳氮源是影響芽孢桿菌形成芽孢的重要因子[6]。芽孢的研究主要集中于芽孢的形成機制和營養(yǎng)因素促進芽孢產(chǎn)生的影響等方面[5-6]，其中，芽孢桿菌芽孢產(chǎn)生的優(yōu)化主要有碳氮源、無機鹽等營養(yǎng)因子以及接種量等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，且都集中在搖瓶水平，優(yōu)化方法較單一、傳統(tǒng)。本研究采用Biolog PM 表型分析系統(tǒng)和全自動生長曲線儀，實現(xiàn)菌株發(fā)酵的高通量和自動化，利用Biolog 系統(tǒng)GenⅢ鑒定板的碳源底物和全自動生長曲線空白板配制不同碳源培養(yǎng)基，實現(xiàn)對碳源的快速篩選和產(chǎn)芽孢能力的測定，并利用2 種設備的專業(yè)軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。利用這2 種儀器研究高地芽孢桿菌YC-9 在不同碳源條件下的產(chǎn)芽孢量和生長周期，以獲得提高YC-9 的產(chǎn)芽孢量和產(chǎn)芽孢率的最佳碳源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

供試菌株：高地芽孢桿菌菌株Bacillus altitudinisYC-9，由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集保藏重點實驗室分離鑒定。

LB 培養(yǎng)基(1L)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。

液體培養(yǎng)基(1L)：碳源 5.0 g，(NH4)2SO43.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0，1×105Pa 滅菌30 min。

碳源篩選培養(yǎng)基(1L)：利于菌體生長的碳源5.0 g，利于產(chǎn)孢的碳源5.0 g，(NH4)2SO43.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (1L)：碳源5.0 g，蛋白胨3.0 g，酵母浸粉 3.0 g，葡萄糖 1.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0～7.2，1×105Pa滅菌30 min。

1.2 Biolog PM 表型鑒定

菌株YC-9 經(jīng)LB 培養(yǎng)基活化后，用無菌棉簽蘸取少量菌體接種于Biolog GenⅢ接種液中，用濁度計將接種液細胞含量調節(jié)為98%T（T表示菌懸液濁度），制成孢子懸浮液備用。將100 μL 制備好的孢子懸浮液分別加入GenⅢ的微孔后放入OmniLog 培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下分別培養(yǎng)12、24、36 h[7]。以Biolog 軟件完成數(shù)據(jù)的格式轉換與處理，以熒光動力曲線下的高度(height)為參數(shù)進行數(shù)據(jù)分析，選3 次試驗的平均高度進行計算。培養(yǎng)結束后收集2 μL 培養(yǎng)液，涂片風干，番紅染色，鏡檢觀察載玻片確定芽孢數(shù)量[8]。每處理設置3個重復。

1.3 單一碳源篩選

以無菌水培養(yǎng)基為對照，將Biolog PM 確定的最適碳源分別作為液體培養(yǎng)基的碳源，用全自動生長曲線儀監(jiān)測菌株YC-9的生長曲線。用無菌牙簽將菌株 YC-9 接種于 LB 培養(yǎng)液，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)12 h后制成接種液。接種液和液體培養(yǎng)基以1∶7的比例混勻，在生長曲線儀100孔培養(yǎng)板中，每個孔加入接種液300 μL，放入全自動生長曲線儀中，每種碳源設置3個重復，即培養(yǎng)板上的3個孔，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h，測定芽孢量。

1.4 碳源組合篩選

以利于菌體生長的碳源和利于產(chǎn)芽孢的碳源進行組合制備碳源篩選培養(yǎng)基，進一步篩選碳源。種子液制備同1.3。種子液以5%的比例接種于裝液量為50 mL 的錐形瓶中（容積250 mL），37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)。每 4 h 測定 1 次 pH 和 OD600值；48 h 時結束發(fā)酵，采用平板菌落計數(shù)法檢測細菌總數(shù)；80 ℃水浴加熱10 min 處理發(fā)酵液，稀釋涂布平板法檢測芽孢量[9]。每種碳源組合設置3個重復。

1.5 搖瓶條件下碳源篩選

在搖瓶條件下，分析不同碳源及碳源添加對菌株YC-9 生長和產(chǎn)孢的影響。以常見碳源葡萄糖為對照組，葡萄糖+篩選碳源為試驗組制備發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液以5%的比例接種至含50 mL組合培養(yǎng)基的錐形瓶中（容積250 mL），培養(yǎng)方法及菌體數(shù)、芽孢數(shù)、pH和OD600值檢測同1.4。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Biolog D5E_OKA_data.exe 軟件收集各菌株的代謝表型數(shù)據(jù)并進行格式轉換，使用Biolog OL_FM_1.2.exe 軟件進行數(shù)據(jù)分析，選3 次試驗平均峰高度進行計算。分別采用GraphPad Prism 8和Origin 9做曲線圖和柱形圖。

2 結果與分析

2.1 Biolog碳源利用情況和產(chǎn)芽孢分析

GenⅢ板含有71 種供試碳源，菌株YC-9 利用各種碳源生長和產(chǎn)孢的情況如表1 所示。利于菌株YC-9 生長和產(chǎn)孢的碳源有4 種，分別為肌醇、果膠、D-果糖-6-磷酸和半乳糖醛酸。產(chǎn)芽孢較多但生長較差的碳源有14種，其中糖類居多，其次是酸類，包括D-松二糖、水蘇糖、D-棉子糖、D-乳糖、蜜二糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨醇、α-羥基丁酸、β-羥基-D,L-丁酸、L-丙氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸。產(chǎn)芽孢量低但利于生長的碳源有16種，包括D-海藻糖、D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、水楊苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、甘油、D-天冬氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、奎寧酸、L-蘋果酸、γ-氨基丁酸和乙酰乙酸。

表1 高地芽孢桿菌菌株YC-9利用GenⅢ板上不同碳源的生長和產(chǎn)孢情況Table 1 Growth and spore yields of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources on GenⅢplate

表1 高地芽孢桿菌菌株YC-9利用GenⅢ板上不同碳源的生長和產(chǎn)孢情況Table 1 Growth and spore yields of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources on GenⅢplate 續(xù)表Continued

以下選擇8 種生產(chǎn)上較為常用、產(chǎn)芽孢量低但利于生長的碳源進行后續(xù)研究，分別為D-海藻糖、D-纖維二糖、水楊苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、甘油、L-蘋果酸。

2.2 不同碳源和碳源組合對菌株YC-9 生長的影響

基于Biolog PM 營養(yǎng)表型分析結果，采用全自動生長儀分析8種單一碳源培養(yǎng)條件下菌株YC-9的生長狀況和產(chǎn)孢能力。綜合圖1 和表2 結果分析，該菌以水楊苷為底物時可以快速生長，培養(yǎng)16 h 的生物量高于其他碳源，但芽孢率在24、36、48 h 時相比于其他碳源都較低；α-D-葡萄糖為底物時，菌體生長呈先上升后下降的趨勢，培養(yǎng)16 h時菌體密度最大，在36和48 h 時芽孢率較高。以L-蘋果酸為底物時，培養(yǎng)24 h 時菌體密度最大，24～32 h 處于平穩(wěn)階段，36 和 48 h 時芽孢率為93%。結合Biolog PM 表型分析結果，水楊苷為芽孢產(chǎn)量低、菌體生長好的最佳碳源。

表2 菌株YC-9在各碳源中的芽孢率Table 2 Spore rate of strain YC-9 by using different carbon sources

圖1 高地芽孢桿菌菌株YC-9在不同碳源條件下的生長曲線Fig.1 Growth curves of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources

基于Biolog PM 表型分析結果和單一碳源篩選結果，選擇7 種芽孢產(chǎn)量高但菌體生長差的碳源與水楊苷組合培養(yǎng)菌株YC-9。以單一碳源水楊苷為對照，菌株YC-9 水楊苷分別與L-鼠李糖、D-山梨醇和D-棉子糖為組合的生長曲線基本一致，細胞量上升較緩慢，培養(yǎng)16 h 達最大菌密度（OD600約為0.46），之后呈平穩(wěn)趨勢；其他3種碳源組合（對照水楊苷、水楊苷+肌醇及水楊苷+半乳糖醛酸組合）上升較快，最大OD600值約在0.8～1.0；其中水楊苷+水蘇糖組合在24 h 后呈緩慢下降趨勢，48 h時OD600值下降至0.7左右（圖2）。

以葡萄糖替代水楊苷，分別與D-山梨醇和肌苷組合成雙碳源。與單一碳源葡萄糖相比，菌株YC-9 的生長曲線變化趨勢大致相同，其中葡萄糖+D-山梨醇的碳源組合相對不利于菌體生長，而葡萄糖+肌苷的碳源組合最利于菌體生長，培養(yǎng)12 h達最大菌密度（圖2）。

圖2 菌株YC-9在不同各碳源組合條件下的生長曲線Fig.2 Growth curves of Bacillus altitudinis YC-9 using different dual carbon sources

2.3 不同碳源組合對菌株YC-9 發(fā)酵液pH 的影響

在搖瓶水平上監(jiān)測不同碳源組合培養(yǎng)下菌株YC-9 發(fā)酵液的pH 變化，以水楊苷與其他碳源組合培養(yǎng)菌株YC-9時，其發(fā)酵液pH 都呈下降趨勢；其中水楊苷+肌醇的組合碳源的發(fā)酵液pH 下降更快，12 h 時低至pH 5.3左右（圖3）。

以常見的工業(yè)發(fā)酵碳源葡萄糖替代水楊苷時，菌株YC-9 的發(fā)酵液pH 變化趨勢呈先下降再上升，pH 由中性變到堿性，高于9.0。其中葡萄糖+D-山梨醇組合的發(fā)酵液pH 較其他2個組合高，而葡萄糖+肌苷組合的發(fā)酵液pH 相對偏小（圖3）。

圖3 不同碳源組合下菌株YC-9發(fā)酵pH Fig.3 Fermentation pH of strain YC-9 under different carbon source combinations

2.4 不同碳源對菌株YC-9生長和產(chǎn)孢的影響

在全自動生長曲線儀上研究不同單一碳源培養(yǎng)下菌株YC-9發(fā)酵液的產(chǎn)芽孢量變化（表2）。菌株YC-9在24 h時以D-海藻糖和甘油為碳源時，芽孢率差異不顯著，但和其他碳源相比芽孢率顯著提高；在36和48 h時以α-D-葡萄糖和L-蘋果酸為碳源時差異不明顯，但產(chǎn)芽孢率和其他碳源相比顯著提高，以L-蘋果酸為碳源時芽孢率均高達93%。結果表明，菌株YC-9在培養(yǎng)36和48 h以α-D-葡萄糖和L-蘋果酸為碳源可明顯提高芽孢率。

同時在搖瓶水平上監(jiān)測不同組合碳源培養(yǎng)下菌株YC-9的48 h內的生長和產(chǎn)孢情況（圖4）。菌株YC-9 在所有的待測培養(yǎng)基中的生長和產(chǎn)孢趨勢一致，培養(yǎng)12 h 時菌體數(shù)較高，在12 和24 h 時芽孢數(shù)較高。在菌體生長方面，以水楊苷+水蘇糖和水楊苷+L-鼠李糖組合為碳源時，菌株YC-9的菌體數(shù)在4個時間點和只添加水楊苷的對照組菌體數(shù)相比均差異顯著（P＜0.05）；在產(chǎn)芽孢方面，水楊苷+肌醇的組合碳源和對照組差異不大，水楊苷+D-棉子糖和水楊苷+L-鼠李糖的組合碳源與對照相比芽孢數(shù)有顯著差異，但芽孢率不高；水楊苷+肌苷和水楊苷+D-山梨醇的組合碳源與對照相比芽孢數(shù)顯著提高，培養(yǎng)24 h 時芽孢率分別為35.67%和23.94%。結果表明，高地芽孢桿菌YC-9 在搖瓶水平上的產(chǎn)孢結果與Biolog PM 表型分析結果一致；水楊苷基礎上添加D-棉子糖、L-鼠李糖、肌苷和D-山梨醇與對照相比芽孢數(shù)差異顯著，其中添加肌苷和D-山梨醇芽孢率相對較高。

圖4 不同碳源組合下菌株YC-9生長和產(chǎn)孢情況Fig.4 The growth and sporulation of Bacillus altitudinis YC-9 under different carbon sources

同時在搖瓶水平上監(jiān)測以葡萄糖替代水楊苷與肌苷或D-山梨醇組合培養(yǎng)菌株YC-9 的生長和產(chǎn)孢情況（圖5）。在菌體生長方面，該菌株在葡萄糖+肌苷的組合碳源與只添加葡萄糖的對照相比菌體數(shù)顯著提高（48 h 時除外），在12 h 時菌體數(shù)高達 3.00×108cfu·mL-1；在產(chǎn)芽孢方面，葡萄糖+D-山梨醇的碳源組合在12和36 h與對照組相比芽孢數(shù)顯著提高，36 h 時芽孢率達56.64%。葡萄糖+肌苷在24 和48 h 與對照組相比顯著提高，24 h 芽孢總量為 3.90×107cfu·mL-1，芽孢率高達60.47%，其他時間點變化不大。結果表明，菌株YC-9以葡萄糖+肌苷為碳源時，芽孢數(shù)增長顯著，且芽孢率是僅以葡萄糖為碳源時的2 倍，并且菌株YC-9 的最佳生長時期為12 h，最佳產(chǎn)芽孢時間為24～36 h。

圖5 不同碳源組合下菌株YC-9生長和產(chǎn)孢情況Fig.5 Growth and sporulation of Bacillus altitudinis YC-9 under different carbon sources

3 討論

芽孢是芽孢桿菌在一定培養(yǎng)條件或生長階段下形成的抗逆性很強的休眠體[10]，受碳氮源、溫度、pH 等影響[11-12]，其中在芽孢形成過程中，碳源是影響芽孢形成的主要因素[13]。徐世榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，通過營養(yǎng)限量可誘導B.subtilis芽孢的形成，根據(jù)不同微生物的需要，選擇適宜的碳源，才能實現(xiàn)菌體或芽孢數(shù)量的提高。本研究表明，高地芽孢桿菌菌株YC-9對碳源的代謝能力較好，以水楊苷為碳源時產(chǎn)芽孢率較低，以L-蘋果酸和α-D-葡萄糖為碳源時產(chǎn)孢率顯著提高。水楊苷對菌株YC-9 產(chǎn)芽孢可能有一定的抑制作用，但對菌體生長有促進效果。α-葡萄糖不僅有利于菌株YC-9菌體生長，也有利于產(chǎn)孢。菌株YC-9 以水楊苷+肌苷和水楊苷+D-山梨醇為組合碳源培養(yǎng)時不利于菌體生長，但顯著提高芽孢產(chǎn)生。Osadchaya等[14]研究表明，通過增加產(chǎn)孢培養(yǎng)基的碳源組成，B.subtilis的細胞生物和芽孢產(chǎn)量較單一碳源時有了顯著提高；當葡萄糖和木糖組成為1∶1 時，芽孢產(chǎn)量是葡萄糖和木糖為單一碳源時的1.43～1.90倍。本研究以葡萄糖替代水楊苷后，菌株YC-9在葡萄糖+肌苷的碳源組合中產(chǎn)芽孢數(shù)較單一葡萄糖提高，且產(chǎn)芽孢率高。

不同的碳源與菌株YC-9的發(fā)酵液pH 息息相關。當培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源時，發(fā)酵液pH在后期都呈弱堿性，此時產(chǎn)芽孢率較高。Khardziani等[15]研究枯草芽孢桿菌KATMIRA 1933 時也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的pH接近中性有利于芽孢桿菌的生長和營養(yǎng)細胞的最大積累，酸化會抑制芽孢桿菌的生長和產(chǎn)孢，而微堿性有利于產(chǎn)孢。本研究確定了高地芽孢桿菌菌株YC-9 的最佳生長和產(chǎn)孢碳源及發(fā)酵時間，初步揭示了高產(chǎn)孢的營養(yǎng)機制，為該菌株的工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵提供了重要的參數(shù)。