吳飛飛 張承宇 盧朝秀 段 濤 申虎威

甲狀腺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速上升[1]。大多數(shù)甲狀腺癌患者經(jīng)手術(shù)及I131放射治療等規(guī)范化治療后預(yù)后良好，但仍有約23%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移甚至惡化，最終確診為難治性分化型甲狀腺癌，10年生存率僅為10%左右[2]。因此，對(duì)難治性分化型甲狀腺癌針對(duì)性治療的研究迫在眉睫。

腫瘤血管再生是癌癥進(jìn)展和代謝的重要標(biāo)志[3-4]，同時(shí)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endthelial growth factor,VEGF)在介導(dǎo)腫瘤血管生長的過程中發(fā)揮著重要作用[5]，許多抗腫瘤研究都集中在抑制VEGF信號(hào)傳導(dǎo)[6-7]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，系統(tǒng)性給予VEGF單克隆抗體可抑制甲狀腺乳頭狀癌的生長[8]，該結(jié)論為利用人源化VEGF單克隆抗體治療難治性分化型甲狀腺癌提供了可靠證據(jù)，但由于人源化抗體多來源于小鼠等動(dòng)物，存在與人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等副作用，而來自于人體細(xì)胞克隆的抗體，即人源性抗體給患者施用時(shí)可減少免疫反應(yīng)[9-10]。

本研究建立了一個(gè)由難治性分化型甲狀腺癌患者外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建的噬菌體展示文庫，并利用重組人VEGF對(duì)該文庫進(jìn)行篩選。經(jīng)過四輪酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法對(duì)陽性菌落的篩選，并通過測序和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步分析獲得了抗VEGF抗體Fab克隆片段，最后利用細(xì)胞水平抑制試驗(yàn)測試它們對(duì)VEGF的抑制活性。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

使用人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(購自上海細(xì)胞庫)進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)來檢測VEGF的活性[11-12]，該效應(yīng)的ED50(半數(shù)有效量)為3 μg·mL-1。

1.2 RNA制備和表達(dá)載體構(gòu)建

取含高滴度VEGF抗體的甲狀腺癌患者外周靜脈血10 mL，使用淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(Pharmacia)離心分離淋巴細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA作為合成cDNA模板，并做RT-PCR(Invitrogen)。使用抗體Fab片段DNA的特異性引物[12]，擴(kuò)增重鏈的VH區(qū)和κ、λ輕鏈。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min后在72 ℃下孵育10 min。擴(kuò)增的κ和λ輕鏈用XbaI和SacI消化，并進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。使用Qiagen試劑盒提取目的條帶。將純化的DNA與XbaI/SacI線性化的pComb3-H載體連接。隨后，用過量的限制性內(nèi)切酶XhoI和SpeI切割重鏈Fd片段，并克隆到含有輕鏈的XhoI/SpeI線性化的pComb3-H中。將重組DNA分子轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue MRF細(xì)胞(Invitrogen)上，提取XL1-Blue MRF樣品(10，1，0.1 μL)進(jìn)行鋪板，以確定轉(zhuǎn)化效果。隨機(jī)抽取幾個(gè)XL1-Blue MRF單克隆質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割驗(yàn)證靶序列。

1.3 噬菌體文庫的包裝

電穿孔后將陽性克隆接種到50 mL 2×YT培養(yǎng)基(含有100 μg·mL-1氨芐西林，30 μg·mL-1四環(huán)素，100 mmol葡萄糖)上搖菌至OD600達(dá)0.025。培養(yǎng)物在37 ℃孵育2 h。在OD600值為0.1時(shí)，加入最大量=8的輔助噬菌VCS-M13(1012pfu)。37 ℃下以80 r·min-1離心30 min，再以260 r·min-1離心30 min。將培養(yǎng)物以4 000 r·min-1速度離心，加入100 μg·mL-1氨芐西林和50 μg·mL-1卡那霉素將培養(yǎng)基改變?yōu)?0 mL 2×YT，培養(yǎng)物在30 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)6 h，之后再次將培養(yǎng)物離心，上清液加入聚乙二醇、氯化鈉至其濃度分別為4%和3%。再將噬菌體文庫在4 ℃下沉淀12 h，然后以8 000 r·min-1離心30 min，將噬菌體沉淀重新懸浮在PBS(pH 7.4)中，并轉(zhuǎn)移到微量離心管中，以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速進(jìn)行最后1次離心10 min，除去不溶性物質(zhì)。構(gòu)建引物Fab噬菌體展示文庫。

1.4 抗VEGF Fab噬菌體展示文庫的篩選

在4 ℃恒溫下用200 μL重組人VEGF-A抗原在微滴板孔上涂敷12 h。3%BSA阻斷后，向每個(gè)孔中加入50 μL噬菌體懸浮液(約107pfu)。將與抗原結(jié)合的噬菌體從孔中洗脫，再次感染XL1-Blue MRF。最后再添加VCS-M13，即完成一輪篩選。經(jīng)過5輪篩選后，產(chǎn)量噬菌體的百分比確定為(篩選的噬菌體數(shù)量/應(yīng)用的噬菌體數(shù)量)×100。

1.5 Fab片段的ELISA分析

用200 μL重組人VEGF-A蛋白抗原在微滴板孔上涂敷12 h，用HEK293 T細(xì)胞全細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照，后將微量滴定板用PBS-3% BSA阻斷1 h；用PBST廣泛洗滌后，在每個(gè)微量滴定板的孔中加入50 μL抗VEGF Fab噬菌體展示庫懸浮液，并在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)2 h；之后再用PBST洗滌3次后，加入50 μL按照1∶20 000比例稀釋的與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗人Fab，37 ℃孵育1 h；最后添加50 μL TMB顯色液，在490 nm處檢測顯色。陽性克隆的A490值比陰性克隆高至少2倍，用1 mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)處理、篩選并誘導(dǎo)克隆，通過離心回收細(xì)胞，并重新懸浮在PBS中；將懸浮液在-70 ℃徹底冷凍后在37 ℃下完全解凍，操作5次以提取Fab抗體，然后以10 000 r·min-1速度離心，用ELISA檢測上清液中的抗體；每種抗體測試5次。

1.6 VEGF特異性Fab克隆片段的序列分析

西格瑪生物技術(shù)公司對(duì)6個(gè)克隆片段(2、6、15、16、22和25)的重鏈和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行了核苷酸測序，測定每個(gè)克隆的雙鏈核苷酸序列；利用DNA Strider和Clustal軟件對(duì)VEGF特異性抗體Fab片段的VH和VL氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.7 VEGF特異性抗體Fab片段的蛋白質(zhì)印跡分析

蛋白印跡分析實(shí)驗(yàn)步驟見試劑盒說明(抗體濃度為1∶2稀釋的抗體Fab6、Fab16，1∶200稀釋的陽性血清和1∶500稀釋的抗人GAPDH)。

1.8 細(xì)胞增殖法分析Fab片段抑制活性

融合的HUVECs用PBS清洗2次，然后使用內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EGM-2，不含血清或生長因子，只含抗生素)加入0.001～1 mM濃度的Fab片段(Fab2、Fab6和Fab16)；分別孵育4 h和24 h后，用25 ng·mL-1重組人VEGF-A蛋白刺激5 min；處理后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀分析緩沖液溶解細(xì)胞；通過雙喹啉酸法測定裂解物的蛋白質(zhì)含量，從第1天至第5天，每隔24 h測1次OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抗VEGF Fab基因的克隆

將PCR擴(kuò)增的κ/λ鏈產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化后連接到pComb3-H載體上，通過電穿孔法導(dǎo)入大腸桿菌XL1-Blue MRF；氨芐西林耐藥克隆的滴定表明輕鏈文庫包含6×106個(gè)獨(dú)立克?。粚CR擴(kuò)增的重鏈產(chǎn)物與輕鏈文庫中提取的DNA連接，生成含有3×107個(gè)克隆的噬菌體展示Fab文庫；隨機(jī)挑選16個(gè)克隆基因并進(jìn)行分析，輕鏈和重鏈插入效率分別約為55.3%和31.2%。

2.2 抗VEGF抗體Fab片段的ELISA分析

利用重組人VEGF-A蛋白對(duì)文庫進(jìn)行篩選；經(jīng)過5輪篩選后，將獲得的噬菌粒DNA導(dǎo)入大腸桿菌XL1-Blue MRF表達(dá)抗VEGF抗體Fab片段，并通過ELISA檢測每個(gè)克?。?個(gè)克隆(2，6，15，16，22，25)在ELISA試驗(yàn)中均表達(dá)了重組人VEGF-A蛋白結(jié)合的Fab抗體，6個(gè)克隆都表現(xiàn)出與VEGF-A蛋白的結(jié)合活性，都未表現(xiàn)出與HEK 293 T細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物的任何結(jié)合活性；其中Fab6、Fab16與重組人VEGF-A蛋白的結(jié)合活性明顯高于其他4種，見表1。

表1 克隆片段與重組人VEGF-A蛋白的結(jié)合活性

2.3 VEGF特異性Fab克隆的序列分析

對(duì)6個(gè)克隆的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列分析表明，它們的重鏈可變區(qū)(VH)序列與抗原表位直接相互作用的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRS)有12個(gè)顯著差異。它們來自不同的種系VH片段，也有體細(xì)胞超突變。相比之下，輕鏈可變區(qū)(VL)序列源自人VK1家族的DPK9種系片段，并且彼此高度同源。見表2。

表2 Fab6和Fab16的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列

2.4 蛋白質(zhì)印跡法分析抗體的特異性和親和力

通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步鑒定了在ELISA中活性較高的2個(gè)克隆片段(Fab6和Fab16)的結(jié)合活性。結(jié)果表明，每種抗體都能特異性結(jié)合重組人VEGF-A蛋白，尤其是Fab6片段活性更強(qiáng)。它們都沒有顯示出與HEK 293 T細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物的任何結(jié)合活性。見圖1。

圖1 VEGF抗體Fab片段的蛋白印跡法分析

2.5 細(xì)胞增殖法對(duì)Fab片段抑制活性的分析

通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT法)測試3個(gè)克隆片段的抑制活性(Fab2、6、16)。3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，3個(gè)克隆片段均表現(xiàn)出抑制活性，其中Fab6片段顯示出明顯的抑制活性，F(xiàn)ab16片段顯示出較弱的抑制活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、表3。

圖2 MTT法對(duì)Fab片段抑制活性比較

表3 MTT法檢測Fab片段抑制活性比較

3 討論

為篩選出可靠的人源性VEGF單克隆抗體，本研究使用重組人VEGF-A蛋白對(duì)高親和力的Fab片段進(jìn)行篩選，并鑒定了一組共6種結(jié)合重組人VEGF-A蛋白的Fab片段，篩選出2種與重組人VEGF-A蛋白高度結(jié)合的Fab片段。篩選程序是從最初由帕爾馬利和史密斯創(chuàng)立的程序修改而來[13-14]。除去非特異性抗體噬菌體后，結(jié)合噬菌體在大腸桿菌XL1-Blue MRF中洗脫并擴(kuò)增。該富集過程重復(fù)5個(gè)循環(huán)，測試每輪篩選后從克隆基因中表達(dá)的可溶性Fab片段對(duì)重組人VEGF-A蛋白的結(jié)合特性。由于重組人VEGF-A蛋白是由HEK 293 T細(xì)胞產(chǎn)生的，因此以HEK 293 T細(xì)胞全細(xì)胞裂解液為陰性對(duì)照，所有6種Fab片段對(duì)HEK293 T細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液均無結(jié)合活性。

絲狀噬菌體是鑒定肽或蛋白質(zhì)藥物的有力工具[15-18]。本研究使用1例具有高滴度VEGF抗體的難治性分化型甲狀腺癌患者的外周血，通過RT-PCR法、載體構(gòu)建、ELISA、MTT等實(shí)驗(yàn)初步構(gòu)建了1個(gè)Fab形式的簡單噬菌體抗體庫，并成功從噬菌體庫中篩選并分析了6種Fab片段，均與VEGF具有結(jié)合活性，并能夠在體外阻斷人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中VEGF的表達(dá)；說明建立噬菌體抗體庫技術(shù)可為人源性抗體的制備提供一條更為便捷的途徑，可推動(dòng)對(duì)腫瘤抗原及腫瘤免疫治療的研究，為難治性分化型甲狀腺癌的治療提供一定的研究基礎(chǔ)，為治療VEGF相關(guān)的癌癥提供了更多的可能性。

綜上所述，本研究顯示噬菌體展示技術(shù)可用于篩選人源性VEGF單克隆抗體，可作為一種潛在的藥物發(fā)現(xiàn)工具，為難治性分化型甲狀腺癌患者的藥物治療研究奠定基礎(chǔ)。