沈朝壯 沈萍萍 王曉虎 李 超 謝海棠

慢性腎衰竭(Chronic renal failure, CRF)是由于各種慢性腎臟疾病未得到有效控制，發(fā)展到后期所導(dǎo)致的臨床綜合征，可引起不可逆的腎臟功能損害[1]。以血肌酐、尿素氮等生化指標(biāo)異常、腎小球濾過率下降、代謝毒物蓄積、水和電解質(zhì)及酸堿失衡等為主要表現(xiàn)，從而導(dǎo)致機體神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、消化系統(tǒng)等臟器功能衰竭。

真武湯源于《傷寒論》，由君藥附子，臣藥茯苓、白術(shù)，佐藥白芍、生姜五味中藥按比例炮制而成，具有溫腎利水、回陽燥濕之功效。相關(guān)研究常用真武湯治療CRF、糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎、腎病綜合征等各種腎臟疾病。

中藥復(fù)方具有“多組分、多靶點”的特點，傳統(tǒng)方法很難對整個復(fù)方進行系統(tǒng)的探討。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強調(diào)從系統(tǒng)層次和網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)的整體角度出發(fā)，分析藥物對疾病潛在的治療機制，為中藥復(fù)雜體系研究提供了新思路。我國在最新發(fā)布的首個《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》[2]中對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的具體評價要求作出詳細的闡述。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法探討真武湯治療CRF的分子作用機制，為真武湯的進一步研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分及靶點篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmsp-e.com)數(shù)據(jù)庫檢索真武湯中五味單藥的有效成分，以類藥性(DL)≥0.18，口服生物利用度(OB)≥30%為篩選條件，篩選出主要有效成分。根據(jù)篩選結(jié)果查詢相關(guān)靶點匯總，并將所有靶點導(dǎo)入Uniprot(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫中查詢基因名進行匹配。

1.2 有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物、有效成分、靶點等信息進行匯總分類構(gòu)建有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進行“Analyze Network”分析，根據(jù)各節(jié)點Degree值對網(wǎng)絡(luò)進行優(yōu)化。

1.3 CRF相關(guān)靶點篩選

以“chronic renal failure”“chronic kidney failure”為關(guān)鍵詞，挖掘OMIM(https://omim.org)，Drugbank(https://go.drugbank.com)，Genecards(https://www.genecards.org)，CTD(http://ctdbase.org)數(shù)據(jù)庫中CRF靶點。將各數(shù)據(jù)庫篩選出的疾病靶點根據(jù)Score值進行排序，Score值越大代表靶點與疾病越相關(guān)，并以Score值的中位數(shù)為基準(zhǔn)[3]，多次取大于中位數(shù)的靶點，4個數(shù)據(jù)庫中所篩選得到的靶點匯總。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將真武湯主要有效成分靶點與CRF靶點取交集，得到的交集靶點導(dǎo)入STRING11.0(https://www.string-db.org)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。物種類別設(shè)置為“Homo sapiens”，閾值為“medium confidence(0.400)”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并隱藏網(wǎng)絡(luò)中無連接的節(jié)點。將構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件優(yōu)化，使用MCODE插件找出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點子網(wǎng)絡(luò)，選取Score值最大的子網(wǎng)絡(luò)。將該子網(wǎng)絡(luò)中所有靶點在有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)聯(lián)的有效成分找出并進行分析。

1.5 KEGG、GO富集分析

為進一步探討交集靶點中可能涉及的信號通路、生物進程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)等信息，將交集靶點導(dǎo)入DAVID(https://david.ncifcrf.gov)數(shù)據(jù)庫進行KEGG和GO分析。設(shè)置標(biāo)識符為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,物種為“Homo sapiens”進行分析，數(shù)據(jù)按P-value值進行排序，最終設(shè)定閾值為P<0.01，篩選相關(guān)信息。

1.6 藥物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)

將處理后的藥物、有效成分、靶點、信號通路、疾病數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進行分析，根據(jù)各節(jié)點Degree值、介度(Betweenness Centrality)及緊密度(Closenesss Centrality)等網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)篩選出起主要藥效作用的成分。將結(jié)果與PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果進行對比，找出兩網(wǎng)絡(luò)篩選出的共同的有效成分及靶點。

1.7 分子對接驗證

綜合上述網(wǎng)絡(luò)篩選出成分和靶點進行分子對接。使用RCSB PDB(https://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)分辨率(Resolution)及相關(guān)性排名選取靶點蛋白骨架，下載“pdb”文件。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫下載有效成分的分子結(jié)構(gòu)“mol2”文件。用AutoDock Vina軟件進行分子對接，選取結(jié)合能最優(yōu)的構(gòu)象與靶點蛋白對接并保存對接后的復(fù)合物文件，將復(fù)合物文件導(dǎo)入Python-Pymol 2.5.0進行最終優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 有效成分及靶點篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫經(jīng)過篩選后得到真武湯中總的有效成分59種，包含附子21種，茯苓15種，白術(shù)7種，白芍13種，生姜5種，其中附子和白芍共有成分1種(谷甾醇)，白芍和生姜共有成分1種(β-谷甾醇)。查詢篩選出的有效成分靶點中附子30個，白芍123個，茯苓30個，白術(shù)23個，生姜75個，將其導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化成基因名，刪除未查詢到基因名的靶點及重復(fù)值，最后保留有效成分靶點95個。

2.2 有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物、成分、靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)由126個節(jié)點和236條邊構(gòu)成。Degree值最高的前3個成分為山奈酚、β-谷甾醇和豆甾醇，且大多有效成分對應(yīng)2個以上靶點，說明真武湯是多組分，多靶點共同作用的結(jié)果。

圖1 有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 交集靶點篩選

挖掘OMIM、Drugbank、Genecards、CTD數(shù)據(jù)庫中CRF靶點，得到2 964個靶點，將篩選出的藥物靶點與疾病靶點取交集，見圖2。結(jié)果得到交集靶點70個。

圖2 疾病靶點“venn”圖(A)及藥物-疾病靶點“venn”圖(B)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將70個交集靶點導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，隱藏1個無相互作用的節(jié)點(SCN5A)后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進行優(yōu)化，該網(wǎng)絡(luò)有69個節(jié)點，547條邊構(gòu)成。利用MCODE插件找出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點子網(wǎng)絡(luò)，選擇Score值最大(17.684)的子網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該子網(wǎng)絡(luò)有20個節(jié)點和168條邊，共對應(yīng)著20個核心靶點。根據(jù)有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，找出與核心靶點相關(guān)聯(lián)的有效成分并統(tǒng)計。結(jié)果顯示，與20個核心靶點相關(guān)的有效成分出現(xiàn)頻次最多的為山奈酚、β-谷甾醇、芍藥苷等。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 KEGG、GO富集分析

將交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進行富集分析，以P<0.01作為閾值進行篩選。共有88條信號通路滿足要求，主要涉及TNF、Toll樣受體、NF-κB、HIF-1等信號通路，選擇前20條通路做圖；GO_BP結(jié)果共有121個條目，主要涉及對藥物的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)等生物進程；GO_CC結(jié)果共有21個條目，主要有膜筏、膜小窩、細胞溶質(zhì)等細胞組分；GO_MF結(jié)果共有36個條目，主要涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同型二聚體活性、類固醇激素受體活性等分子功能。3種GO分析結(jié)果均取前10個條目作圖。匯總結(jié)果見圖4。

圖4 KEGG和GO富集圖

2.6 藥物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

找出前20條通路對應(yīng)靶點，以及靶點對應(yīng)有效成分，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件作圖，結(jié)果見圖5。該網(wǎng)絡(luò)有71個節(jié)點和284條邊，根據(jù)Degree值、介度及緊密度等網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)進行分析，找出可能起藥效作用的主要成分及核心靶點。結(jié)果顯示可能起藥效作用的主要成分為山奈酚、β-谷甾醇、芍藥苷等。找出前20個核心靶點，與PPI網(wǎng)絡(luò)的前20個核心靶點對比，有13個共同靶點，找出2個網(wǎng)絡(luò)篩選的核心靶點所相關(guān)聯(lián)的有效成分，2個結(jié)果都提示山奈酚、β-谷甾醇、芍藥苷可能是起主要藥效作用的有效成分。

圖5 藥物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對接驗證

根據(jù)Degree值及頻數(shù)綜合選取兩網(wǎng)絡(luò)篩選靶點進行分子對接，選取結(jié)果及其結(jié)合能見表1。一般認為受體和配體的結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1說明兩者有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能≤-7.0 kcal·mol-1可認為其具有強結(jié)合活性[4]。將對接結(jié)果導(dǎo)入Python-Pymol 2.5.0進行最終的可視化，見圖6。

表1 分子對接結(jié)果數(shù)據(jù)

圖6 分子對接圖

3 討論

真武湯屬溫陽利水之方，主治陽虛水泛之癥，被收錄于《古代經(jīng)典名方目錄(第1批)》，其復(fù)方中附子為君藥，溫陽驅(qū)冷；茯苓、白術(shù)為臣藥，健脾燥濕；白芍和生姜為佐藥，化濕利水，所以臨床上多采用真武湯治療CRF。

結(jié)果顯示山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇分別與AKT1、TNF、IL6、MAPK8、RELA、TGFB1等靶點顯著相關(guān)。山奈酚屬于天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、改善微循環(huán)、矯正受損代謝通路等作用[5]，相關(guān)研究表明其可通過抑制NF-κB因子水平、調(diào)控MAPK信號通路等途徑來發(fā)揮抗炎抗氧化作用，以此來改善腎功能[6-7]。β-谷甾醇是一種天然植物類甾醇，是多種中藥的重要成分，相關(guān)研究已證明其具有抗炎抗氧化等作用[8]。SHARMILA等[9-10]在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可通過激活NRF-2的抗氧化酶活性降低腎毒性小鼠的血肌酐、尿素、尿酸及iNOS表達水平，且在針對腎癌小鼠的相關(guān)試驗中，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以降低CYCLIN-D1、PCNA等蛋白表達水平，增高CAS及BAX表達水平，提示其可以通過誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖及血管生成達到改善腎癌的相關(guān)作用。芍藥苷是一種單萜類糖苷化合物，是白芍總苷中的主要活性成分。在對芍藥苷的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)節(jié)TLR2、TLR4等信號通路來改善糖尿病腎病大鼠的腎功能[11]。

AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白參與多種生物學(xué)過程，包括代謝、增殖、細胞生長、血管生成等，是急性腎損傷轉(zhuǎn)化為慢性腎臟疾病的相關(guān)治療靶點[12]。山奈酚可通過PI3K/Akt介導(dǎo)的相關(guān)信號通路抑制氧化應(yīng)激和細胞凋亡[13]；TNF與IL6屬炎癥因子，參與全身的炎癥，相關(guān)研究表明其在加速腎小球硬化的過程中起到重要作用[14]。山奈酚和芍藥苷可通過調(diào)節(jié)TNF和IL6因子水平改善炎癥，起到抗炎作用[15-16]；MAPK8又稱絲裂原激活蛋白激酶8，相關(guān)研究也表明調(diào)節(jié)其水平的變化可減輕細胞外基質(zhì)積聚進而發(fā)揮腎臟保護作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)山奈酚抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的遷移和侵襲，是通過阻斷該通路的激活而起作用的[18]；RELA屬NF-κB/Rel家族成員，ZHAO等[19]在研究腎臟中的Klotho激素水平與糖尿病腎病炎癥的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)節(jié)RELA相關(guān)靶點通路改善腎功能；PTGS2是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，可促進血管生成，抑制細胞凋亡。PTGS2基因可編碼環(huán)氧合酶2(COX-2)，COX-2與炎癥、維持鈉和水的平衡、控制腎素釋放、腎血管擴張、血管收縮減弱和產(chǎn)前腎臟發(fā)育有關(guān)，在腎衰竭期間，COX-2的mRNA和蛋白水平以及酶活性都會隨著前列腺素E2的增加而增加[20]。

KEGG通路富集分析顯示，真武湯治療CRF與調(diào)節(jié)TNF、Toll樣受體、NF-κB、HIF-1等信號通路有關(guān)。TNF信號通路主要與細胞的分化、凋亡和炎性反應(yīng)的誘發(fā)有關(guān)，TNF-α 拮抗藥可改善腎臟炎癥并減少蛋白尿[21]。Toll樣受體是一類重要的蛋白質(zhì)分子，常參與非特異性免疫過程，在治療急性腎損傷時有多方面作用[22]。NF-κB通路在細胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起到關(guān)鍵性作用，CHENG等[23]研究表明肝細胞生長因子可通過NF-κB通路治療Ⅱ型糖尿病誘導(dǎo)的慢性腎功能衰竭。HIF-1又稱低氧誘導(dǎo)因子，孫靜等[24]研究表明真武湯可通過上調(diào)HIF-1α的表達保護腎小管上皮細胞的缺氧損傷。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從藥物、有效成分、靶點、通路等方面系統(tǒng)的闡述了真武湯治療CRF的作用機制，將多種分析結(jié)果合并討論篩選，最終篩選出可能起主要作用的成分及靶點，方法較為完整，且篩選結(jié)果大多有相關(guān)文獻支持。后續(xù)研究仍需繼續(xù)對篩選結(jié)果進行下一步探索，可以真武湯中單體成分為主要研究對象，針對篩選靶點進行動物或細胞試驗，為基礎(chǔ)研究和臨床用藥提供依據(jù)。