黃 鑫，賈福艷，劉良月，關(guān) 鑫，楊沛文，郭紅霞，張 雙，楊雪葳，黃成田*

(1.沈陽(yáng)沈化院測(cè)試技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110021；2.沈陽(yáng)化工研究院有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110021)

1 前言

精甲霜靈，又名為高效甲霜靈，對(duì)瓜果、蔬菜上的疫病、霜病毒，煙草黑脛病、辣椒霜霉病等病害防治效果明顯[1-4]。現(xiàn)階段，對(duì)精甲霜靈殘留量的報(bào)道主要集中于煙葉、番茄、馬鈴薯、人參、葡萄、黃瓜等[5-8]，分析方法多為液相色譜法和氣相色譜法，未見(jiàn)精甲霜靈在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上的分析報(bào)道。我國(guó)GB2763-2021規(guī)定精甲霜靈的殘留物定義為甲霜靈。

吡唑醚菌酯，又名唑菌胺酯，是具有殺菌譜廣、活性高、持效期長(zhǎng)、毒性低、對(duì)非靶標(biāo)生物安全的殺菌劑[9]，對(duì)于真菌性病害如銹病、葉枯病、霜霉病、白粉病等有很好的防治效果，其作用機(jī)理是干擾細(xì)胞間能量的供給，造成細(xì)胞中能量不足，進(jìn)而起到殺菌的作用[10]。

氰霜唑，化學(xué)名稱(chēng)為4-氯-2-氰基-N，N-二甲基-5-對(duì)甲苯基咪唑-1-磺酰胺，對(duì)霜霉病、疫病如黃瓜霜霉病、葡萄霜霉病、番茄晚疫病、馬鈴薯晚疫病等有極高的抑制活性。氰霜唑在使用后會(huì)迅速分解，主要降解產(chǎn)物為CCIM[11]。我國(guó)GB2763-2021規(guī)定氰霜唑的殘留物定義為氰霜唑和代謝物CCIM之和。

目前，尚未見(jiàn)同時(shí)檢測(cè)葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留分析方法。本文建立了采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的殘留分析方法，方法選擇性好，回收率高，分析時(shí)間短，適合葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的痕量分析。

2 試驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑 島津LC-AD高效液相色譜(日本島津公司)-質(zhì)譜聯(lián)用儀(API4500QTrap，美國(guó)AB公司)；電子分析天平(0.000 1g和0.01g，賽多利斯)；回旋振蕩器HY-5(常熟國(guó)華電器有限公司)；超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)。

乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；乙酸(分析純，西隴化工有限公司)；甲酸(色譜純，F(xiàn)isher)；PSA(40-60μm，60?，博納艾杰爾科技有公司)；C18(50μm，60?，博納艾杰爾科技有限公司)；氯化鈉(分析純，西隴化工有限公司)。

甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.5%；吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.0%；氰霜唑標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.2%；CCIM標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.3%。

2.2 樣品前處理 稱(chēng)取10.00g(±0.01g)粉碎后的空白葡萄樣品于150mL三角瓶中，加入50mL乙腈(含1%乙酸)，振蕩提取30min，再加入約6g氯化鈉，旋渦混勻約30s，靜置分層后，取2.00mL乙腈層，加入100mg PSA、50mg C18凈化，漩渦混勻約30s，過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，待HPLC-MS/MS檢測(cè)。

2.3 儀器分析條件

2.3.1 液相色譜條件 液相色譜柱：Waters Acquity UPLC C1850mm×2.1mm ，1.7μm；柱溫：40℃；流速0.4mL/min；進(jìn)樣體積：10.0μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)

2.3.2 質(zhì)譜條件 電離源模式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子；離子源電壓：4500V；離子源溫度：450℃；EP電壓：10V；CXP電壓：9V。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 儲(chǔ)備液配制：分別稱(chēng)取甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品0.025 38g，氰霜唑標(biāo)準(zhǔn)品0.025 20g，吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品0.025 51g，CCIM標(biāo)準(zhǔn)品0.025 18g于25mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度線(xiàn)，配得濃度均為1 000mg/L儲(chǔ)備液，于-4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別用乙腈和葡萄空白基質(zhì)配制0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05和0.1mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于考察基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 添加回收率試驗(yàn) 取空白葡萄樣品，加入一定量的甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0.01、0.1和1.0mg/kg 3個(gè)水平下進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平設(shè)置5個(gè)重復(fù)。經(jīng)2.2處理后測(cè)定，計(jì)算回收試驗(yàn)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC-MS/MS條件選擇

3.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 分別配制質(zhì)量濃度為0.1mg/L的甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的標(biāo)準(zhǔn)溶液，首先在Q1 SCAN模式下分別進(jìn)行了正離子掃描和負(fù)離子掃描，發(fā)現(xiàn)正離子掃描信號(hào)強(qiáng)度較高，因而選擇正離子掃描，確定4種化合物的母離子。然后在Product Ion Scan模式下得到高質(zhì)量的MS2圖，確定化合物的子離子。最后根據(jù)前面選出的母離子、子離子，組件MRM離子對(duì)，優(yōu)化CE和DP。最終優(yōu)化好的質(zhì)譜參數(shù)(表2)，標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖(圖1)。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mg/L)(a)；吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mg/L)(b)；氰霜唑標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mg/L)(c)；CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mg/L)(d)

3.1.2 液相條件優(yōu)化 本試驗(yàn)選擇Waters Acquity UPLC C1850mm×2.1mm，1.7μm和Agilent Extend C1850mm×4.6mm，3.5μm兩種色譜柱進(jìn)行峰型和響應(yīng)比較，發(fā)現(xiàn)1.7μm優(yōu)于3.5μm。

分別選擇乙腈：水、乙腈：0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水3種不同的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)乙腈：水作為流動(dòng)相時(shí)CCIM有拖尾的現(xiàn)象，乙腈：0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)4種化合物峰型較好，且0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)4種化合物均獲得較高的響應(yīng)，因此選擇0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 前處理?xiàng)l件選擇 通常根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和樣品成分來(lái)選擇提取溶劑。依據(jù)相似相溶原理，本試驗(yàn)先選擇了乙腈作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)CCIM的回收率偏低，不能滿(mǎn)足回收率要求。然后選擇甲醇進(jìn)行提取，4種農(nóng)藥回收率均能滿(mǎn)足要求，但葡萄樣品糖分含量較高，雜質(zhì)較多，甲醇提取范圍較大，提取出的提取液雜質(zhì)也較多。而向乙腈提取液中加入乙酸后，4種農(nóng)藥的回收率均能滿(mǎn)足要求，且提取液較干凈，因此最后選擇1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

3.3 基質(zhì)影響評(píng)價(jià) 分別用乙腈、空白葡萄提取液配制甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照先后順序進(jìn)行檢測(cè)，并分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)比較斜率的偏差，評(píng)價(jià)基質(zhì)的影響，結(jié)果(表3)。甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在葡萄中的基質(zhì)效應(yīng)均為弱基質(zhì)效應(yīng)。因此我們?cè)跈z測(cè)葡萄中甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM時(shí)，可選擇乙腈配制系列工作溶液。

表3 葡萄中甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的基質(zhì)效應(yīng)

3.4 方法的線(xiàn)性、回收率、精密度 分別以甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，以對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)作圖，結(jié)果表明，甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在0.001～0.1mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)r均>0.99。

4種農(nóng)藥在葡萄基質(zhì)中分別進(jìn)行3個(gè)水平的添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)5次。采用外標(biāo)法定量，甲霜靈在葡萄中的平均回收率為84%～86%，RSD為1.3%～3.8%，吡唑醚菌酯在葡萄中的平均回收率為89%～92%，RSD為2.2%～3.8%，氰霜唑在葡萄中的平均回收率為87%～89%，RSD為5.2%～6.7%，CCIM在葡萄中的平均回收率為83%～91%，RSD為3.8%～5.4%，甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在葡萄中殘留檢測(cè)方法的定量限(LOQ)均為0.01mg/kg，符合農(nóng)藥殘留分析方法要求[12]。

表4 葡萄中添加回收試驗(yàn)(n=5)

4 結(jié)論

本文建立了一種能夠同時(shí)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)葡萄樣品中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留分析方法。該方法前處理簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、儀器選擇性高，滿(mǎn)足樣品殘留分析的要求，適用于葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留檢測(cè)。