吳佳佳，朱佳紅，曹坳程，顏冬冬，王秋霞，張春華，李 園

（1農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；2福貢縣農(nóng)業(yè)局，植保植檢站，云南怒江 673499）

0 引言

草果在中國(guó)西南地區(qū)（云南，貴州，廣西）和越南北部及亞洲其他地區(qū)廣泛種植[1]。云南省是草果的主要產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量和種植面積約占中國(guó)的95%[2]。據(jù)2016年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，云南草果的種植面積為22.93萬(wàn)hm2，其中紅河州為6.93萬(wàn)hm2[3]。先前的研究表明，草果精油對(duì)病原體具有不同程度的抑制作用[4-6]，可作為中藥材和香料，具有商業(yè)價(jià)值，已成為當(dāng)?shù)卮迕褡钪匾氖杖雭?lái)源之一[7-8]，近幾年栽培規(guī)模擴(kuò)增明顯，已成為云南省福貢縣的支柱產(chǎn)業(yè)。提高草果的產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)于增加農(nóng)民的收入和增加中國(guó)中藥的出口已經(jīng)變得非常重要。因此，及時(shí)科學(xué)診斷病害并提出具體的防治藥劑，對(duì)于提高草果產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

由于常年連作，土傳病害嚴(yán)重，影響了草果的產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。Guo等[10]報(bào)道稱，在云南屏邊縣，草果出現(xiàn)了黑斑病癥狀。對(duì)于草果產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō)，土傳病害是巨大的挑戰(zhàn)。草果的生長(zhǎng)環(huán)境溫暖濕潤(rùn)，這也為病原菌提供了良好的繁殖環(huán)境。草果真菌病害種類多、分布廣、危害大，各種病害從癥狀上難以區(qū)分，導(dǎo)致防治困難。常見的草果病害包括枯萎病，葉斑病和炭疽病，近年來(lái)，隨著草果種植面積的擴(kuò)大，草果真菌病害的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，且多種病害復(fù)合發(fā)生，已成為限制草果產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題[11-12]。因此，確定草果主要病害的致病菌，篩選出有效的化學(xué)防治藥劑，對(duì)促進(jìn)草果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

為了明確引起草果致病菌種類以及有效的防治藥劑，本研究從云南省福貢縣采集草果病株，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。確定分離到的菌株為禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌，為首次在草果中分離得到。同時(shí)使用了7種常用的殺菌劑，以評(píng)估對(duì)分離出的病原菌的抑制效果，從而找到合適的殺菌劑用于田間病害防治，減少由草果病害引起的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與防治藥劑

2019年5月15日，對(duì)中國(guó)云南省福貢縣草果進(jìn)行了田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大約40%的植株出現(xiàn)了病害，并采集了35份具有不同典型、明顯病癥的草果葉片、莖稈和根的病害樣本和25份健康樣本帶回實(shí)驗(yàn)室，用清水將其沖洗并晾干，分別進(jìn)行了病組織病原菌的分離與鑒定試驗(yàn)以及致病性測(cè)定。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)所用的殺菌劑為異菌脲、代森錳鋅、嘧菌酯、藍(lán)楷、京彩、秀苗、施灰樂(lè)均在市場(chǎng)上購(gòu)買所得（表1）。

表1 7種殺菌劑和初篩濃度

1.2 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)特征觀察

通過(guò)常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌的分離和培養(yǎng)。從草果葉片和果實(shí)病健交界處切下3 mm×3 mm×1 mm的小塊，用70%酒精消毒30 s，然后轉(zhuǎn)移到1%次氯酸鈉溶液中并浸泡2 min。然后無(wú)菌水洗滌3次，置于PDA+S培養(yǎng)基上，并在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)7天[13]。等培養(yǎng)基上長(zhǎng)有菌落后，將不同類型的菌落挑出并轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，直到純化出單個(gè)病原菌形態(tài)。產(chǎn)孢后，用顯微鏡觀察分生孢子，測(cè)量其大小。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

在無(wú)菌操作臺(tái)上，用刀片輕輕刮下培養(yǎng)皿中病原菌菌絲，并將其收集至EP管中，采用TakaRa試劑盒進(jìn)行DNA提取。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：5 U/μLTaq酶0.25 μL，10×PCR buffer(Mg2+plus)5 μL；2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL；10 ng 模板DNA 1 μL；10 μmol/L ITS1/ITS4 引物各1 μL；滅菌雙重蒸餾水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，電壓85V，電泳時(shí)間30 min，Bio-Rad凝膠成像儀進(jìn)行觀測(cè)、拍照。

先用真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增rDNA-ITS(ITS)序列[14]。將PCR產(chǎn)物送至華大公司測(cè)序，測(cè)得的序列在Gene Bank中進(jìn)行Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)序列比對(duì)，分析序列同源性。為了進(jìn)一步的確定分離菌株H1，通過(guò)用簡(jiǎn)并引物EF1和EF2對(duì)EF1-α基因的一部分（登錄號(hào)MN308186）進(jìn)行擴(kuò)增。為了進(jìn)一步的確定分離菌株T1，對(duì)肌動(dòng)蛋白(ACT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，分析確定分離得到的菌株[15]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)BLAST搜索結(jié)果，從NCBI官網(wǎng)下載相關(guān)序列，然后用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（表2）。

表2 引物序列

1.4 致病性測(cè)定

致病性測(cè)定試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行。首先在溫室里種植20株草果，生長(zhǎng)15天后，此時(shí)苗高30 cm，平均分為兩組，10株為對(duì)照組，10株為試驗(yàn)組。將分離出的病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，并用無(wú)菌水收集孢子。將孢子懸浮液調(diào)節(jié)至1×108個(gè)孢子/mL，并噴在試驗(yàn)組草果的葉和莖上。然后將兩組草果分別放置在20±1℃和70%相對(duì)濕度的溫室中，每天觀察發(fā)病情況并記錄。待接種發(fā)病后，觀察致病力，并從病部再分離病原菌，比較所分離病原菌與原接種病原菌是否一致。

1.5 室內(nèi)抑菌效果的測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法評(píng)價(jià)殺菌劑對(duì)植物病原菌的抑制效果[16]。首先用無(wú)菌水溶解藥劑，分別配制成100、100、10 mg/mL的母液，然后添加到PDA培養(yǎng)基（約50℃）中，分別配置成異菌脲(0.25、0.5、1 mg/mL)、代森錳鋅(0.625、1.25、2.5 mg/mL)、嘧菌酯(0.45、0.9、1.8 mg/mL)、藍(lán)楷（100倍液、400倍液、1500倍液）、京彩（100倍液、400倍液、1500倍液）、秀苗（100倍液、400倍液、1500倍液）、施灰樂(lè)（100倍液、400倍液、1500倍液）的含藥培養(yǎng)基，搖勻后倒平板，殺菌劑濃度設(shè)置見表3。以添加無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)。待平板凝固后，用打孔器從長(zhǎng)好的菌落邊緣打取4 mm直徑菌餅接入平板后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，待對(duì)照菌絲將近長(zhǎng)滿平皿時(shí)，以十字交叉的方式測(cè)定菌落的直徑。按公式(1)計(jì)算相對(duì)抑菌率。

表3 7種供試殺菌劑濃度設(shè)置

其中Y為菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)，d0為真菌盤直徑，d1為處理菌落直徑，d2為對(duì)照菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果病害癥狀及病原菌形態(tài)觀察

從田間采集的樣品來(lái)看，開始時(shí)草果病株葉片有橢圓形黃褐色病斑，病斑逐漸增加，連成一片，整個(gè)葉片萎焉枯黃。草果莖基部和果實(shí)出現(xiàn)紅色，剝開表皮，維管束變成紅褐色，有紅色顆粒附著，嚴(yán)重時(shí)，莖基部干枯變紅（圖1）。

圖1 草果枯萎病和炭疽病發(fā)病癥狀

根據(jù)菌株在PDA平板上的形態(tài)、顏色、大小等特征，本實(shí)驗(yàn)室從草果病組織上分離出了2種真菌病原菌。從草果莖基部分離出H1，在PDA平板上培養(yǎng)5天后，分離菌株H1的菌落是圓形和絨毛狀的，氣生的菌絲變得密集，菌落變成胭脂紅，帶有白色的邊緣，并在其中產(chǎn)生了紅色素（圖2A）。將該分離的真菌轉(zhuǎn)移到康乃馨葉瓊脂(CLA)中以誘導(dǎo)孢子形成。顯微鏡下觀察到大分生孢子，孢子大小為(43～90)μm×(2.7～5.4)μm。分生孢子的大分生孢子不等長(zhǎng)，有4～6個(gè)裂片，有足形的基底細(xì)胞和細(xì)長(zhǎng)的頂端細(xì)胞，形狀像鐮刀（圖2B）。菌落和分生孢子的形態(tài)與F.graminearum的描述相符[17]。

在草果葉片上分離的T1的菌落呈地毯狀并密集，菌落的外圓為白色，中間部分為灰色，黑色至深綠色。生長(zhǎng)到后期的菌落在培養(yǎng)基表面顯示可見的粉紅色，偶爾可見的黑點(diǎn)散在分生孢子群（圖2C）。菌落和分生孢子的形態(tài)，與Weir[18]描述相同。孢子是無(wú)色且呈圓柱形的，測(cè)量了大約15個(gè)孢子，它們的寬度為3.58～5.72 μm，長(zhǎng)度為10.45～17.35 μm（圖2D）。

圖2 禾谷鐮刀菌(A)和膠孢炭疽菌(C)的菌落和分生孢子形態(tài)特征

2.2 病原菌分子鑒定

病原ITS-PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，條帶大小為500k～700 kb，清晰單一，PCR產(chǎn)物直接送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

圖3 病原菌ITS-PCR鑒定結(jié)果

2.3 序列信息及比對(duì)結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，H1和T1的ITS序列全長(zhǎng)分別為501 bp和547 bp，將此序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，與禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)，序列同源性高達(dá)100%。為了進(jìn)一步鑒定分離菌株H1，使用特異性引物EF1/EF2擴(kuò)增EF-1α區(qū)域，將此序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，與禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，序列同源性高達(dá)100%。為了進(jìn)一步鑒定分離菌株T1，分別使用特異性引物738R/512F和GDF/GDR擴(kuò)增了T1的ACT和GAPDH基因區(qū)域。將此序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，與膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)序列同源性分別高達(dá)99.18%和95.06%。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS基因序列構(gòu)建分離菌株H1和T1的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株H1與已登錄的Fusarium graminearum(MN017275.1)和Fusariumasiaticum(MK791240.1)聚于相同進(jìn)化支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果和EF-1α基因鑒定結(jié)果確定菌株H1為禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)；發(fā)現(xiàn)菌株T1與已登錄的Colletotrichumgloeosporioides(MN473209.1)聚于相同進(jìn)化支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果和ACT和GAPDH基因鑒定結(jié)果確定菌株T1為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)（圖4）。

圖4 基于ITS基因序列構(gòu)建分離菌株H1和T1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 致病性分析

將分離的菌株中，即禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌，接種于草果的幼葉。在室內(nèi)接種3天后，草果葉片表面出現(xiàn)黃褐色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)外圈為黃色，中間為褐色至黑色，并伴有黑點(diǎn)（圖5）。對(duì)莖組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)莖內(nèi)病變部位呈血紅色，有紅色顆粒狀物質(zhì)附著。接種組發(fā)病率為80%，對(duì)照組草果葉片健康，未出現(xiàn)病害癥狀。選擇具有典型發(fā)病癥狀的草果莖葉，重新進(jìn)行病原菌分離與鑒定。結(jié)果表明，再次分離得到的菌株菌落形態(tài)與分離得到的菌株相同，符合柯赫氏法則，證明該菌株是引起草果病害的致病菌。

圖5 草果接種分離菌株H1和T1后莖葉的癥狀

2.6 7種殺菌劑室內(nèi)抑菌效果

采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法進(jìn)行7種殺菌劑室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)，圖6為加殺菌劑培養(yǎng)后菌絲的生長(zhǎng)情況，可以看出用藥以后，不同的殺菌劑不同濃度對(duì)于病原菌的抑制效果也不同。所選的7種殺菌劑對(duì)草果上分離所得的3種病原菌的防治效果見表3。由表3可知，對(duì)于禾谷鐮刀菌，所選的7種殺菌劑中京彩的防治效果達(dá)到93%以上。對(duì)于炭疽病菌，代森錳鋅在田間推薦量區(qū)間內(nèi)可以百分百防治。藍(lán)楷、京彩、施灰樂(lè)低濃度時(shí)對(duì)其防治效果均達(dá)到了90%以上，防治效果極好，他們對(duì)擬莖點(diǎn)霉菌屬病原菌也有極好的防治效果。總之，京彩、施灰樂(lè)、代森錳鋅、藍(lán)楷4種藥劑對(duì)這2種病原菌均有較好的防治效果。

圖6 異菌脲、代森錳鋅、嘧菌酯、藍(lán)楷、京彩、秀苗、施灰樂(lè)7種殺菌劑作用于病原菌后菌絲生長(zhǎng)情況

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，草果病害發(fā)生嚴(yán)重，其主要病害包括枯萎病，葉斑病和炭疽病。這些病害的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，而且兩種病害復(fù)合發(fā)生現(xiàn)象嚴(yán)重，成為限制草果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因之一。國(guó)內(nèi)有一些關(guān)于草果病害鑒定的報(bào)道，大多只采用了病原菌形態(tài)特征鑒定，并且也很少見到在云南省怒江州種植的草果發(fā)生病害的報(bào)道[20-21]。本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定并結(jié)合ITS，TEF，ACT和GAPDH序列分析確定病原菌的分類地位，分離鑒定出草果枯萎病和炭疽病的致病菌為禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌。據(jù)我們所知，這是由禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌引起的草果病害的國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。

表4 7種殺菌劑室內(nèi)抑制效果

禾谷鐮刀菌可侵染小麥、玉米等多種作物，引起小麥赤霉病和玉米穗腐病，而且還能產(chǎn)生真菌毒素，例如脫氧雪腐烯醇(DON)，降低作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[22-23]。禾谷鐮刀菌侵染后，果實(shí)，莖部，根部都會(huì)表現(xiàn)癥狀，侵入維管束后，維管束變成褐色，葉部病斑多不規(guī)則，在潮濕環(huán)境下，病部會(huì)出現(xiàn)紅色霉層[24-25]。本試驗(yàn)結(jié)果與其他作物分離出來(lái)的禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)致病菌一致，在國(guó)內(nèi)屬于首次發(fā)現(xiàn)。此外，ITS序列分析驗(yàn)證了病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，但僅ITS序列分析不能確定禾本科植物的分類地位。因此，為了進(jìn)一步鑒定分離物H1，用特異性引物EF1/EF2擴(kuò)增H1的EF1-α基因。

膠孢炭疽菌能夠侵染草莓、柑橘、芒果等作物，可引起炭疽病的發(fā)生[26-28]。典型癥狀是葉片邊緣和表面出現(xiàn)斑點(diǎn)。病害發(fā)生初期，葉片上出現(xiàn)小的褐色斑點(diǎn)，擴(kuò)張后呈近圓形和橢圓形。病害發(fā)生后期，病斑的中心變?yōu)榛野咨翜\棕色，并且在病斑上出現(xiàn)小黑點(diǎn)。為了進(jìn)一步鑒定分離物T1，用特異性引物對(duì)肌動(dòng)蛋白(ACT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。這些致病菌對(duì)草果病害癥狀的影響將需要在未來(lái)的研究中進(jìn)行解釋。

云南當(dāng)?shù)匚催M(jìn)行草果主要病原菌對(duì)不同種類殺菌劑的防治篩選試驗(yàn)，在藥劑防治中存在較大盲目性和隨意性，以致草果病害造成損失不斷增加。筆者針對(duì)生產(chǎn)需要，選取7種常見藥劑進(jìn)行草果病原菌的室內(nèi)篩選試驗(yàn)。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)表明，在選擇的7種殺菌劑中，京彩對(duì)禾谷鐮刀菌的防治效果高達(dá)93%，可以有效地控制禾谷鐮刀菌。對(duì)于膠孢炭疽菌，在劑量推薦的范圍內(nèi)，代森錳鋅能實(shí)現(xiàn)100%防治。據(jù)陳俊華等[29]報(bào)道膠孢炭疽菌對(duì)代森錳鋅高度敏感。在低濃度下，藍(lán)楷、京彩和施灰樂(lè)對(duì)膠孢炭疽菌均取得了90%以上的防治效果，防治效果極佳。其中藍(lán)楷是啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的復(fù)合殺菌劑，具有殺菌廣譜性，還可以與其他不同作用機(jī)理的殺菌劑混用。京彩是一種與苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯復(fù)合的內(nèi)吸性殺菌劑。其作用機(jī)理是線粒體呼吸抑制劑，具有廣譜、低毒、環(huán)保，還可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，抗早衰，有增產(chǎn)功效。施灰樂(lè)是一種是苯胺基嘧啶類殺菌劑，對(duì)灰霉病具有較好的防治效果，具有保護(hù)、治療、內(nèi)吸和熏蒸作用，通過(guò)抑制病原菌侵染酶的分泌，阻止病原菌的侵染。施灰樂(lè)可在植物體內(nèi)迅速傳導(dǎo)，殺菌較迅速?gòu)氐?。代森錳鋅是一種保護(hù)性殺菌劑，在噴霧后可在農(nóng)作物表面形成致密的保護(hù)膜，以抑制病原菌的萌發(fā)和侵染。

結(jié)果表明，京彩，施灰樂(lè)，代森錳鋅和藍(lán)楷這4種殺菌劑對(duì)這2種致病菌具有良好的防治效果，而且這4種殺菌劑毒性低，可作為防治草果主要病害的首選或輪換藥劑。本試驗(yàn)為防治草果病害提供了一定參考，但鑒于目前，草果病害的防控主要是單一化學(xué)防治殺菌劑，而病原菌具有廣泛的宿主范圍，快速的繁殖和較大的遺傳變異等特點(diǎn)，很容易產(chǎn)生抗藥性。特別是不科學(xué)地使用內(nèi)吸殺菌劑或增加施藥量已經(jīng)在一定程度上降低了病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性，形成了耐藥性基團(tuán)，導(dǎo)致化學(xué)防治效果不好，并且缺少大范圍的田間試驗(yàn)。因此，防治草果病害中，為了延長(zhǎng)藥劑的使用壽命，減少或延遲病原菌抗藥性，今后還應(yīng)該輪換使用不同種類的藥劑，也可以使用生物農(nóng)藥[30]，并開展大范圍的田間試驗(yàn)，進(jìn)一步明確使用范圍和條件，為云南草果病害防治提供依據(jù)。

本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定并結(jié)合ITS，TEF，ACT和GAPDH序列分析確定引起草果主要病害的病原菌是禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，并通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法，明確7種殺菌劑對(duì)草果主要病害的防治效果，旨在為云南草果病害防治提供依據(jù)。結(jié)果表明，對(duì)于禾谷鐮刀菌，所選的7種殺菌劑中京彩的防治效果達(dá)到93%以上；對(duì)于膠孢炭疽菌，代森錳鋅在田間推薦量區(qū)間內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)百分百防治，并且藍(lán)楷、京彩、施灰樂(lè)低濃度時(shí)對(duì)膠孢炭疽菌的防治效果均達(dá)到了90%以上。推薦京彩、施灰樂(lè)，代森錳鋅和藍(lán)楷作為云南省草果主要真菌病害的優(yōu)選兼治藥劑。