尚進，孫書雅，彭紅梅，王輝，馬慜悅，程延飛，孔娜娜，姚元慶，6*

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 100853；2.香港大學李嘉誠醫(yī)學院婦產科系，香港；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心婦產科，北京 100853；4.深圳市生育調控重點實驗室，香港大學-深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，深圳 518053；5.中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心婦產科，北京 100048；6.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心婦產科，北京 100010)

人類白細胞抗原-G(human leucocyte antigen G，HLA-G)屬于非經典的主要組織相容性復合物Ⅰ類(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)分子，選擇性高表達于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細胞中。HLA-G基因位于人染色體6號短臂遠側6p21.3，全長6.0 kb，基因編碼8個外顯子和7個內含子。其轉錄產物經選擇性剪切產生7種mRNA異構體，分別編碼4種膜結合型HLA-G(membrane-bound HLA-G，mHLA-G)，即HLA-G1～HLA-G4，以及3種可溶型HLA-G(soluble HLA-G，sHLA-G)，即HLA-G5～HLA-G7。

卵母細胞的成熟過程離不開它和卵丘細胞(cumulus cells，CCs)之間的雙向作用[1-2]。在卵泡內，卵母細胞被顆粒細胞(granulosa cells，GCs)群體包圍，在卵泡形成過程中，GCs群體分化為壁層顆粒細胞和卵丘細胞。壁層顆粒細胞排列在卵泡壁上，CCs更接近卵母細胞。成熟的卵冠丘復合物(cumulus-oocyte complex，COCs)由次級卵母細胞和周圍的CCs組成，CCs具有高度特異性的跨帶胞質突觸，穿透透明帶并在其頂端與卵母細胞形成縫隙連接，這種密切的聯(lián)系使CCs能夠發(fā)揮重要作用，支持卵母細胞的成熟，并向卵母細胞傳遞內分泌和其他環(huán)境信號[3]。

以往研究提示，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中患者的卵泡液內檢測到可溶型HLA-G(sHLA-G)[4]。Dumesic等[5]也證明成熟的COCs培養(yǎng)上清內可檢測到sHLA-G，可能是優(yōu)質卵母細胞成熟的標志，有助于選擇最佳受精卵以減少培養(yǎng)和移植的胚胎數(shù)量。卵泡液以及COCs上清液中的HLA-G很可能來源于最接近卵母細胞的卵丘細胞，通過其特異的免疫作用調節(jié)卵母細胞的發(fā)育成熟，并可能影響胚胎的發(fā)育著床。本研究旨在檢測人卵丘細胞HLA-G分子及其各亞型的表達，探究HLA-G分子在卵泡發(fā)育和卵子成熟中的可能作用。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年12月至2020年3月于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心行輔助生殖技術助孕治療的不孕癥患者的卵丘細胞。

納入標準：(1)獲取的卵細胞全部行卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)；(2)女性患者卵巢功能正常(因輸卵管因素或男方因素行輔助生殖治療)。

排除標準：(1)女性患者卵巢功能異常：卵巢功能低下或多囊卵巢綜合征；(2)已知的子宮縱膈、宮腔粘連或宮腔畸形患者；(3)直徑在4 cm以上的子宮肌瘤，或粘膜下肌瘤，或嚴重突向宮腔的肌壁間肌瘤等可能影響著床和胚胎發(fā)育者；(4)染色體異常、免疫性不孕、子宮內膜炎、遺傳疾病、其他系統(tǒng)慢性疾病、其他嚴重器質性疾病等。

共收集10例符合標準的不孕癥患者的卵丘細胞。所有樣本均在征得患者知情同意下進行采集，其使用和處理均按中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會相關管理監(jiān)督條例及標準進行，取得倫理委員會決議(第S2019-296-01號)同意。

二、主要試劑和儀器

1.試劑：人卵丘細胞培養(yǎng)用DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)；免疫熒光染色用Triton X-100、BSA(北京碧云天)、DAPI(Sigma，美國)；微滴式數(shù)字PCR中AMPure XP Beads(Beckman，美國)、KAPA library amplification kit(Thermo，美國)、QubitTMdsDNA HS Assay Kit(Invitrogen，美國)。

2.儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)；微滴式數(shù)字PCR儀(Bio-Rad，美國)；Qubit(Thermo，美國)。

三、研究方法

1.樣本收集：收集符合納入標準的患者的卵丘細胞。取卵完成后，將收集到的COCs加入透明質酸酶，卵丘細胞與卵母細胞分離，將卵母細胞放回培養(yǎng)箱，收集剩余的卵丘細胞，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液混勻。將混勻后的細胞懸液離心，棄除上清液，加入適量PBS，再次離心后，棄上清。收集沉淀的卵丘細胞，一部分保存于PCR管中，加入PBS保存于-80℃，留待微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)檢測；另一部分加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，并將細胞懸液轉移至激光共聚焦培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，留作免疫熒光共聚焦染色。

2.卵丘細胞內HLA-G的免疫熒光染色：顯微鏡下觀察卵丘細胞生長情況，若細胞呈梭形貼壁生長，密度均勻，則可開始進行免疫熒光染色。(1)細胞固定透化：PBS洗滌卵丘細胞后，室溫下4%多聚甲醛固定細胞，再次PBS洗滌。含有0.2%Triton X-100的PBS孵育樣品，棄Triton，PBS洗滌細胞。(2)封閉和免疫染色：1%BSA-PBS孵育細胞后吸去液體風干。1%BSA-PBS稀釋一抗(1∶100)。共聚焦皿中滴加一抗(陰性對照為不含一抗的稀釋液)，4℃冰箱孵育過夜。室溫靜置30 min復溫，倒出溶液，將細胞在PBS中清洗3次。加入1%BSA-PBS 稀釋的二抗(1∶500)，黑暗中PBS清洗細胞3次，滴加DNA染色劑(DAPI)上避光孵育細胞，再次用PBS清洗細胞2次。于激光共聚焦顯微鏡下觀察卵丘細胞內HLA-G分子的表達及其所在位置分布，并進行圖像采集。

3.微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)測定卵丘細胞內HLA-G mRNA水平：(1)逆轉錄：參照kit說明程序配置逆轉錄體系，直接裂解細胞、進行mRNA逆轉錄，所得的cDNA溶液置于-20℃保存。利用AMPure XP beads和磁力架重復純化2次，室溫風干去掉殘留乙醇。加入Low-TE Buffer留取上清液純化后cDNA待用。(2)第一步PCR：進行第1輪 PCR反應，向PCR反應溶液中加入DNase/RNase-free water和AMPure XP beads，再次行DNA純化，吸取上清液待用。(3)Qubit定量：取Qubit assay tubes分別標記#1、#2以及待檢測的樣本編號，同時將Qubit dsDNA HS Standard #1及Qubit dsDNA HS Standard #2渦旋混勻離心。將Qubit dsDNA HS Reagent以Qubit dsDNA HS Buffer按1∶200稀釋，配成Qubit檢測工作液。向Qubit assay tubes#1和#2中分別加入Qubit檢測工作液，向其余標記樣本編號的離心管中分別加入Qubit檢測工作液。再向標記#1、#2的離心管中加入對應的Qubit dsDNA HS Standard #1及Qubit dsDNA HS Standard #2；向標記各樣本編號的離心管中加入對應DNA樣本，混勻后離心，將各樣本離心管分別置于Qubit 2.0 Fluorometer中讀數(shù)，計算樣本濃度。(4)EvaGreen-ddPCR定量：按照Qubit定量結果將樣品梯度稀釋至2 pg/μl，在伯樂液滴生成儀中生成液滴，轉移至96孔板，置于封膜儀封膜。再次運行PCR程序，將完成擴增的PCR板置于QX200閱讀儀中，進行液滴信號閱讀。

基因引物序列：在第1輪PCR中，正向引物位于外顯子1，反向引物跨越外顯子5和6，從而可以擴增出所有的HLA-G mRNA亞型。在第2輪ddPCR中，設計了跨越相鄰兩個外顯子之間的引物，以分別區(qū)分每個HLA-G mRNA亞型，即G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7。另外設計了一套引物，用于同時擴增HLA-G的所有亞型(Pan HLA-G)。引物序列見表1。

表1 擴增HLA-G mRNA亞型的PCR引物

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、HLA-G在卵丘細胞中的表達分布

利用免疫熒光染色技術，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，結果顯示：HLA-G蛋白于人卵丘細胞細胞膜和細胞漿內均有分布(圖1)。

藍色為卵丘細胞核DAPI染色；綠色為HLA-G染色；Merge為兩種波長熒光疊加結果。圖1 激光共聚焦顯微鏡下人卵丘細胞內HLA-G的表達

二、ddPCR檢測卵丘細胞中HLA-G 各亞型mRNA表達差異

ddPCR檢測人卵丘細胞內HLA-G各亞型絕對定量表達水平。結果顯示，HLA-G3表達量最多，HLA-G4次之，HLA-G6表達量最少。其中HLA-G3和HLA-G4與其他各亞型相比均有顯著差異(P<0.05)；膜結合型HLA-G總體表達量顯著高于可溶型HLA-G(P<0.001)(表2，圖2)。

表2 ddPCR檢測人卵丘細胞中HLA-G亞型絕對定量表達水平(-±s)

A：HLA-G各亞型表達水平。與其他亞型比較，*P<0.05；B：膜結合型HLA-G與可溶型HLA-G表達水平。與可溶型比較，#P<0.001。圖2 ddPCR檢測卵丘細胞中HLA-G亞型表達

討 論

成功妊娠有兩個關鍵因素：一是母體對胎兒的免疫耐受，二是早期胚胎的發(fā)育和著床。盡管近年來輔助生殖技術的發(fā)展迅速，但臨床妊娠率卻難以達到顯著提高。對于卵母細胞的優(yōu)選目前存在諸多方法：(1)評估卵丘細胞產生的類固醇激素[6]；(2)形態(tài)良好和不良的卵母細胞之間的線粒體分布和ATP水平[7]；(3)卵泡的血管形成[8]；(4)測量膜完整性[9]；(5)營養(yǎng)物質攝取[10]。這些技術中大部分具有侵入性，需要特定儀器和豐富經驗的操作者，并且與卵母細胞和胚胎的質量相關性較低，存在許多局限性。尋找合適的生物標志物來評估高質量的卵母細胞以及胚胎具有很高的必要性。

卵丘細胞及其分泌物的檢測作為間接評估卵母細胞質量的手段具有可行性。卵母細胞與相鄰的卵丘細胞之間的雙向信號交換對卵母細胞的能力獲得、早期胚胎發(fā)育和卵丘的擴張具有重要意義，卵母細胞和卵丘細胞之間的代謝合作已經被確定為卵母細胞成熟的決定因素[11-12]。卵丘細胞在排卵后仍與卵母細胞保持松散聯(lián)系，在卵母細胞離開卵巢的過程中繼續(xù)支持卵母細胞[13]。此外，卵母細胞周圍卵丘細胞的質量在胚胎著床過程中也起著重要作用，研究表明卵丘細胞表達血管內皮生長因子和前列腺素也可調節(jié)胚胎著床過程中的血管生成等過程[14]。

免疫微環(huán)境對卵母細胞發(fā)育質量有著重要影響。正常女性卵子中的顆粒細胞表達MHC Ⅰ和Ⅱ類分子，而在自身免疫性卵巢衰竭患者中觀察到負責免疫反應的激活MHC Ⅱ類抗原調節(jié)增加[15]。Rizzo等[4]在卵泡液中檢測到可溶型HLA-G(sHLA-G)的濃度高于其他人體體液，Borgatti等[16]也發(fā)現(xiàn)sHLA-G可能是優(yōu)質卵母細胞成熟的標志物。因此，卵泡液內HLA-G分子的產生可能與抑制自身免疫反應的機制相關，維持卵泡免疫微環(huán)境的細胞因子平衡狀態(tài)，影響卵母細胞質量，從而間接影響胚胎發(fā)育著床過程。而卵泡液中sHLA-G極可能來源于最接近卵母細胞的卵丘細胞。最新研究通過相對定量PCR和免疫印記技術證實了卵丘細胞中確實存在HLA-G的表達[17]，但對于HLA-G亞型的表達情況還未見相關研究報道。

本研究利用共聚焦免疫熒光技術和微滴式數(shù)字PCR技術檢測卵丘細胞的細胞膜及細胞質中HLA-G分子的表達，并發(fā)現(xiàn)了HLA-G各亞型在卵丘細胞內的表達水平差異。不同于傳統(tǒng)的相對熒光定量PCR(RT-PCR)法，數(shù)字PCR是無需標準曲線的絕對定量檢測，具有更高的檢測靈敏度和數(shù)據(jù)精密度[18]，能更直觀精確地比較出HLA-G各亞型的表達量。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G3及HLA-G4表達水平顯著高于其他亞型，二者均為膜結合型，而各可溶型HLA-G表達普遍低于膜結合型HLA-G。因此HLA-G3和HLA-G4可能在卵丘細胞中發(fā)揮更為主要的作用。

絨毛和蛻膜HLA-G亞型的表達不盡相同。HLA-G3、HLA-G4和HLA-G7 mRNA在胎盤中很少存在，HLA-G5存在于整個胎盤中以及絨毛膜、蛻膜和母血中，可識別HLA-G2/-G6的抗體顯示，在胎盤絨毛遠端的絨毛外滋養(yǎng)層細胞、浸潤蛻膜的滋養(yǎng)層細胞和一些絨毛膜滋養(yǎng)層細胞可見其表達[19]。HLA-G1與β2-微球蛋白結合的HLA-G5和HLA-G2/G6僅存在于細胞滋養(yǎng)層柱的前緣和蛻膜中的細胞滋養(yǎng)層細胞[20]；HLA-G5在滋養(yǎng)層細胞亞群中普遍存在，可以作為游離重鏈由細胞滋養(yǎng)層前體干細胞和胎盤細胞滋養(yǎng)層產生，或與輕鏈β2-微球蛋白結合，由絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞產生[20]。

不同于母-胎界面，卵丘細胞表達的HLA-G亞型主要為HLA-G3和HLA-G4，其在卵丘細胞中的作用機制還有待于進一步探索。本實驗研究了HLA-G及其亞型在卵丘細胞中的表達，為了解HLA-G在卵母細胞生殖發(fā)育中的作用提供了新的發(fā)現(xiàn)。