淡清華，駱海燕，張雨彤，高小博，陸彩玲*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100005)

卵泡是卵巢的基本結(jié)構(gòu)與功能單位，每個卵泡由一個卵母細(xì)胞及周圍包裹的顆粒細(xì)胞和外層的卵泡膜包裹而成。根據(jù)Pedersen等[1]對卵泡的描述，卵泡發(fā)育分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡四個階段。原始卵泡一般處于休眠中，只有少數(shù)原始卵泡被激活發(fā)展到竇卵泡階段進(jìn)一步排卵，大部分卵泡會發(fā)生閉鎖[2]。卵泡生長期包括顆粒細(xì)胞增殖、分化和卵母細(xì)胞生長等過程，卵泡的成熟主要是在促性腺激素誘導(dǎo)下通過顆粒細(xì)胞介導(dǎo)調(diào)控[3]。多條信號通路參與卵泡發(fā)育的調(diào)控，包括磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路和MAPK信號通路等[4]。PI3K-AKT信號通路主要在原始卵泡向初級卵泡發(fā)育階段發(fā)揮作用，加速原始卵泡的募集[5]。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它將下游的AKT招募到細(xì)胞膜上，通過傳導(dǎo)信號促進(jìn)卵泡的存活、生長和卵母細(xì)胞活化[6-7]。張力蛋白同源物(PTEN)是具有磷酸酶活性的抑癌基因[8]，McLaughlin等[9]研究發(fā)現(xiàn)PTEN抑制劑導(dǎo)致PI3K-AKT通路過度激活，促進(jìn)AKT磷酸化，加速原始卵泡發(fā)育。MAPK信號通路主要參與卵泡發(fā)育中顆粒細(xì)胞的分化，高濃度的cAMP激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶A(PKA)，PKA 繼而轉(zhuǎn)錄激活目的基因，合成特異性蛋白，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[10-11]。

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是一類具有干擾內(nèi)環(huán)境平衡及生殖發(fā)育過程的外源性物質(zhì)，包括農(nóng)藥、工業(yè)化學(xué)物質(zhì)等環(huán)境污染物[12]。五氯硝基苯(PCNB)是一種具有EDCs性質(zhì)的有機(jī)氯農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的拌種、殺菌及花草樹木的病蟲防害[13]。PCNB化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難降解，通過食物鏈的傳播長期暴露于食物供應(yīng)和飲水中，對動物的生殖系統(tǒng)有毒性作用[14]。Arora等[15]研究發(fā)現(xiàn)口服PCNB的孕鼠在其后代中表現(xiàn)出腭裂以及胎兒死亡率升高等。王新[16]報道PCNB對小鼠睪丸產(chǎn)生毒性和氧化損傷作用，精子畸形率增加，引發(fā)生殖健康風(fēng)險。我們實(shí)驗室前期報道PCNB能改變青春前期大鼠卵巢甾體激素的合成水平，加速原始卵泡的發(fā)育[17-18]。在此我們探索PCNB影響青春前期大鼠卵泡發(fā)育的分子機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗材料

1.實(shí)驗動物：SPF級青春前期雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，21日齡，體重55～60 g，購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，于國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SCXK(京)2016-0006。動物室溫度22～24℃，空氣相對濕度50%～70%，12 h晝/夜循環(huán)照明，保證大鼠充足的食水。所有實(shí)驗均通過國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號2016-017)。

2.主要試劑和設(shè)備：五氯硝基苯(Sigma，美國)；玉米油(阿拉丁，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo，美國)；P-AKT兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；AKT兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；PTEN兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；β-actin小鼠抗人單克隆抗體(Thermo，美國)；山羊抗兔/小鼠IRDye-800CW二抗(LI-COR，美國)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(Branson SLP，美國)；全自動酶標(biāo)儀(Bioteck，美國)；紅外激光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR，美國)；Real-Time PCR System PCR儀(ABI，美國)；倒置生物顯微鏡(Nikon，日本)；低溫高速離心機(jī)(Biotool，瑞士)；Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，美國)。

二、研究方法

1.動物分組及染毒：將14只21日齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗組，每組7只。實(shí)驗組采用PCNB(100 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥，對照組給予等體積玉米油。每日1次，連續(xù)7 d。

2.動物一般情況觀察：包括精神狀態(tài)、進(jìn)食、活動情況。每天測量大鼠體重，根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量。最后一次染毒24 h后，用戊巴比妥鈉麻醉后取血保存于普通真空采血管中，待大鼠安樂死后，分離雙側(cè)卵巢，去掉筋膜與脂肪組織，電子天平稱卵巢重，得出卵巢系數(shù) [卵巢系數(shù)(%)=卵巢濕重(mg)/體重(g)×100%]。一側(cè)卵巢置于10%甲醛溶液中固定，另一側(cè)卵巢置于液氮罐備用。

3.蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各級卵泡：卵巢在10%甲醛溶液中充分固定72 h后進(jìn)行脫水，卵巢組織切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。以每個卵巢切面上不同發(fā)育階段卵泡數(shù)各占整個卵巢切面上總卵泡數(shù)的百分比表示各級卵泡的發(fā)育情況。卵泡分級參照文獻(xiàn)分類方法[1]：原始卵泡由一個中央的卵母細(xì)胞和單層扁平的顆粒細(xì)胞組成；初級卵泡由中央的卵母細(xì)胞及周圍單層的立方狀顆粒細(xì)胞組成；次級卵泡的卵母細(xì)胞被2層或者2層以上的顆粒細(xì)胞包圍，沒有形成竇腔；竇卵泡中包含2層或者2層以上的顆粒細(xì)胞，有竇腔形成。生長卵泡總數(shù)是初級卵泡數(shù)、次級卵泡數(shù)和竇卵泡數(shù)之和。

4.卵巢組織樣品RNA-Seq測序：對照組與實(shí)驗組分別選取2個卵巢組織樣本，進(jìn)行 RNA 提取，利用Agilent 2100生物分析儀對組織樣品RNA的完整性進(jìn)行評估，RNA完整性系數(shù)≥7的樣本用于后續(xù)分析。根據(jù)制造商的說明書，使用TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA構(gòu)建文庫。然后在Illumina測序平臺上對文庫進(jìn)行測序。

利用 DESeq軟件[19]對不同樣本基因的counts數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(采用BaseMean值來估算表達(dá)量)，計算差異倍數(shù)，并采用負(fù)二項分布檢驗的方式(NB)對reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗，最終根據(jù)差異倍數(shù)(Fold change值)及差異顯著性檢驗結(jié)果q值(Pvalue值)來篩選差異蛋白編碼基因。篩選對應(yīng)差異表達(dá)基因(|log2 Fold change|>2，q<0.05)的GO 條目和pathway條目，并用超幾何分布檢驗的方法分析GO和KEGG富集分析，以校正后的q<0.05為閾值，滿足此條件的GO詞條和KEGG通路被認(rèn)為具有顯著性。

5.卵巢組織蛋白質(zhì)提取定量及Western blot檢測：切取部分大鼠卵巢組織，加入組織裂解液及蛋白酶抑制劑，超聲粉碎后冰上繼續(xù)裂解30 min。4℃、13 000 r/min離心15 min，收集上清，利用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)稀釋的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用一抗(P-AKT；AKT；PTEN；β-actin)4℃孵育過夜；PBST洗膜后加入二抗室溫孵育1 h；最后用紅外激光掃描成像系統(tǒng)顯示目的條帶，ImageJ軟件分析蛋白灰度值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、PCNB對大鼠生長及卵泡發(fā)育的影響

青春前期雌性SD大鼠連續(xù)灌胃7 d，對照組和實(shí)驗組大鼠毛發(fā)、體形及精神狀態(tài)均無明顯異常。體重測量結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗組大鼠體重增長無顯著性差異(P>0.05)(圖1 A)。與對照組相比，實(shí)驗組卵巢系數(shù)輕微增加，但無顯著性差異(P>0.05)(圖1 B)。HE染色與卵泡計數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗組大鼠的原始卵泡數(shù)量顯著減少(P<0.05)，生長卵泡的數(shù)量顯著增加(P<0.01)，而卵泡總數(shù)沒有明顯變化(P>0.05)(圖1C、D、E和F)。這些結(jié)果表明PCNB加速了青春前期SD大鼠原始卵泡的發(fā)育，與我們前期報道[18]相符。

A：大鼠體重；B：卵巢系數(shù)；C：HE染色(標(biāo)尺=1 000 μm)；D：總卵泡數(shù)；E：原始卵泡占總卵泡數(shù)的百分比；F：生長卵泡占總卵泡數(shù)的百分比。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 PCNB處理后大鼠體重、卵巢系數(shù)及卵泡數(shù)目的變化情況

二、PCNB對大鼠卵巢組織基因表達(dá)情況的影響

為了探究PCNB影響大鼠卵巢卵泡發(fā)育的分子機(jī)制，我們將對照組和實(shí)驗組的大鼠卵巢組織進(jìn)行RNA-Seq分析，根據(jù)蛋白編碼基因的表達(dá)量進(jìn)行差異篩選，檢測到差異基因數(shù)量共有261個(|log2 Fold change| >1，q<0.05)。與對照組相比，實(shí)驗組共有62個基因表達(dá)顯著上調(diào)，199個基因表達(dá)顯著下調(diào)(圖2A)。差異分布火山圖和差異基因聚類分析結(jié)果顯示，PCNB暴露引起大鼠卵巢組織內(nèi)基因表達(dá)發(fā)生顯著改變，其中差異表達(dá)幅度排在前10位的上調(diào)基因包括Kcne2、Lect1和Rho等，下調(diào)基因包括Aqp4、Elf3和Pigr等(圖2B和2C)。

A：差異表達(dá)基因統(tǒng)計柱狀圖；B：差異基因表達(dá)火山圖；C：差異基因分組聚類圖(標(biāo)注出差異表達(dá)幅度排在前10位的上調(diào)基因和下調(diào)基因)。|log2 Fold change| >1，q<0.05。圖2 PCNB處理后大鼠卵巢組織差異基因分布情況

三、大鼠卵巢組織差異表達(dá)基因的 GO分析和KEGG富集分析

GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞分化、蛋白磷酸化、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及ATP結(jié)合的微管裝配等(圖3A)。KEGG 富集條目結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在PI3K-AKT信號通路、cAMP信號通路及MAPK信號通路上，其中富集到PI3K-AKT信號通路的差異基因數(shù)量較多(圖3B)。綜合KEGG結(jié)果分析，提示PCNB對大鼠卵巢PI3K-AKT信號通路的影響更為明顯。

A：GO富集分析展示圖；B：KEGG富集分析氣泡圖。圖3 PCNB處理大鼠卵巢組織內(nèi)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能及分子信號通路的富集情況

四、PCNB對大鼠卵巢PI3K-AKT通路的影響

為了確定PCNB對PI3K-AKT通路的調(diào)控，我們檢測了大鼠卵巢AKT的磷酸化水平及PTEN的表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗組AKT磷酸化水平顯著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)(圖4)，表明PCNB抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K-AKT信號通路。

A：Western Blot檢測；B：蛋白相對表達(dá)水平柱狀圖(以對照組為1標(biāo)準(zhǔn)化)。與對照組比較，*P<0.05圖4 PCNB處理后P-AKT及PTEN的蛋白表達(dá)情況

討 論

我們前期報道PCNB改變青春前期大鼠卵巢內(nèi)甾體激素孕酮合成，加速原始卵泡發(fā)育[18]。本研究我們主要對PCNB暴露影響大鼠卵泡發(fā)育的分子機(jī)制進(jìn)行探究。

卵泡發(fā)育受多種生長因子和信號通路的復(fù)雜調(diào)控。為了探究PCNB影響大鼠卵巢卵泡發(fā)育異常的分子機(jī)制，我們將對照組和PCNB實(shí)驗組的大鼠卵巢組織通過RNA-seq測序篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞分化、蛋白磷酸化和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，特別是在微管裝配上富集較多，可能與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸或細(xì)胞分裂過程中微管的組裝有關(guān)。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因富集的分子信號通路主要包括PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路和cAMP信號通路等，其中PI3K-AKT信號通路富集的差異基因數(shù)目相對較多。PI3K-AKT信號通路是卵泡發(fā)育早期的關(guān)鍵通路，調(diào)節(jié)原始卵泡的活化和生長[20]。Hannon等[21]報道工業(yè)污染物鄰苯二甲酸單乙基己基酯通過過度激活PI3K信號通路加速了體外培養(yǎng)小鼠整個卵巢內(nèi)早期卵泡的發(fā)育。趙倩[22]發(fā)現(xiàn)雙酚A主要通過過度激活PI3K-AKT信號通路發(fā)揮促進(jìn)原始卵泡發(fā)育的作用。結(jié)合我們的測序和生物信息學(xué)分析結(jié)果，提示PCNB可能影響PI3K-AKT信號通路調(diào)控卵泡發(fā)育。

為了確定PCNB對PI3K-AKT通路的影響，Western blot結(jié)果顯示實(shí)驗組較對照組AKT的磷酸化蛋白水平顯著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)。PTEN是PI3K-AKT信號通路的負(fù)調(diào)控因子，Reddy等[23]發(fā)現(xiàn)敲除PTEN的小鼠原始卵泡加速生長，導(dǎo)致原始卵泡池的早期耗盡。Jagarlamudi等[24]通過特異性敲除初級卵泡和生長卵泡卵母細(xì)胞中的PTEN發(fā)現(xiàn)，PI3K通路下游信號AKT磷酸化水平增加，加速原始卵泡的募集。我們的研究結(jié)果表明PCNB抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K-AKT通路，提示PCNB可能通過激活PI3K-AKT通路加速了大鼠原始卵泡的發(fā)育。MAPK信號通路主要參與促性腺激素誘導(dǎo)下卵巢顆粒細(xì)胞的增殖調(diào)控，促進(jìn)卵泡的成熟[10]。在我們前期報道中，PCNB激活大鼠原代顆粒細(xì)胞和卵巢組織有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK3/1)信號通路[18]。另外已有研究證明MAPK信號通路參與大鼠原始卵泡的活化與生長，Zhao等[25]用MAPK3/1信號抑制劑培養(yǎng)新生鼠卵巢，發(fā)現(xiàn)原始卵泡數(shù)量減少。這些數(shù)據(jù)提示除了PI3K-AKT信號通路，MAPK通路也參與了PCNB對大鼠卵泡發(fā)育的影響。

有機(jī)氯農(nóng)藥具有內(nèi)分泌干擾活性，可長時間殘留在土壤及食品中，殘留的農(nóng)藥本身和代謝產(chǎn)物可能會危害生物體的健康[26-27]。有機(jī)氯農(nóng)藥PCNB進(jìn)入體內(nèi)可代謝為五氯苯酚、五氯苯胺和甲基五氯苯基硫醚等多種產(chǎn)物。其中五氯苯酚可干擾類固醇受體導(dǎo)致雌魚激素紊亂和性腺退化等不良反應(yīng)[28]。有研究發(fā)現(xiàn)五氯苯酚暴露加速雌性虹鱒魚卵母細(xì)胞發(fā)育，減少了可排卵的細(xì)胞數(shù)量[29]。提示PCNB對大鼠卵巢發(fā)育和功能的干擾可能也與其代謝物五氯苯酚有關(guān)。

綜上所述，PCNB處理激活PI3K-AKT信號通路，抑制PTEN的蛋白表達(dá)，加速了大鼠原始卵泡發(fā)育。我們的研究初步闡述了PCNB暴露影響青春前期大鼠卵泡發(fā)育的分子機(jī)制，為基于毒理機(jī)制的PCNB生殖健康風(fēng)險評估提供了實(shí)驗依據(jù)。