李志偉 任然悅 李孟偉 劉起昆 于小鈞 蔣詠橋 鮑遠(yuǎn) 康皓

異三聚體G 蛋白是一種重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器，主要傳遞來自G 蛋白偶聯(lián)受體的信號，使胞外信號穿膜轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號，其有三個亞基：α、β和γ［1］。其中，鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞基α13（Gα13）屬于G 蛋白超家族的G12 亞家族，廣泛表達(dá)于哺乳動物多種細(xì)胞中［2］。已有研究報道，Gα13是一種破骨細(xì)胞形成的負(fù)調(diào)控因子，其通過抑制Akt-GSK3β-NFATc1信號通路，抑制破骨細(xì)胞形成［3］。

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量低，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病［4］。我國60 歲以上人口已超過2.1億（約占總?cè)丝诘?5.5%），65歲以上人口近1.4億（約占總?cè)丝诘?0.1%）［5］。而且骨質(zhì)疏松癥及骨折的醫(yī)療和護(hù)理，需要投入大量的人力、物力和財力，因此骨質(zhì)疏松癥給家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

中藥淫羊藿常用于治療骨質(zhì)疏松癥，其主要成分淫羊藿苷可通過抑制破骨細(xì)胞的形成來抑制骨質(zhì)疏松癥［6-7］。淫羊藿苷調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的正調(diào)節(jié)信號通路已有報道［8-10］，但通過調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)節(jié)通路與負(fù)調(diào)控因子來抑制破骨細(xì)胞生成的研究較少。因此，本研究利用核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stlimulating factor，M-CSF）體外誘導(dǎo)小鼠骨髓單核細(xì)胞（bone marrow derived macrophages，BMMs）分化成破骨細(xì)胞的模型，探討Gα13及Akt-GSK3β-NFATc1信號通路是否參與淫羊藿苷對破骨細(xì)胞的調(diào)控，從而研究淫羊藿苷對破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的作用機(jī)制，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供新的思路和依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料與儀器

淫羊藿苷（美國MCE公司），M-CSF（美國Pepro-Tech 公司），RANKL（美國R&D 公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒（美國Sigma 公司），鬼筆環(huán)肽、DAPI染色液、SYBR qPCR Mix（上海翊圣公司），總RNA 提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek 公司），PCR 引物由武漢擎科生物公司合成，C57/BL6小鼠購于鼠來寶（武漢）生物科技有限公司。恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（香港Heal Force 公司），光學(xué)、熒光顯微鏡（日本Nikon公司），凝膠電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、實時定量PCR儀（美國Bio-BAD公司）。

二、骨髓單核細(xì)胞的分離提取

用含有M-CSF（30 ng/mL）的α-MEM培養(yǎng)基沖出C57/BL6 小鼠（6 到8 周齡）脛骨和股骨骨髓腔中的骨髓單核細(xì)胞（BMMs），在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24 h后收集瓶底未黏附的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，作為純化的BMMs使用［11］。

三、TRAP染色鑒別破骨細(xì)胞

BMMs細(xì)胞接種于96孔板（2×104個/孔），24 h后加入100 ng/mL的RANKL，誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，同時加入不同濃度（0、1、10 μmol/L）的淫羊藿苷，設(shè)一不加RANKL空白對照組，每組設(shè)3復(fù)孔?？偣舱T導(dǎo)干預(yù)5～7 d［12］。應(yīng)用TRAP 染色試劑盒對誘導(dǎo)至終點的細(xì)胞進(jìn)行染色，計算各組破骨細(xì)胞數(shù)目（破骨細(xì)胞為具有三個或更多細(xì)胞核融合而成的TRAP陽性細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個視野）。

四、鬼筆環(huán)肽染色檢測細(xì)胞骨架F-actin 環(huán)形成分析

BMMs 細(xì)胞接種于96 孔板（2×104個/孔），分組及RANKL 誘導(dǎo)和淫羊藿苷干預(yù)同上。加入免疫染色固定液，室溫固定10 min，用免疫染色洗滌液洗滌3次后，用鬼筆環(huán)肽室溫避光染色30 min，加入DAPI染色液復(fù)染30 s，熒光顯微鏡下觀察，拍照［13］。

五、破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因表達(dá)水平的分析

BMMs 細(xì)胞接種于6 孔板（50×104個/孔），實驗分組同上，RANKL 誘導(dǎo)和淫羊藿苷干預(yù)3～5 d 后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，并行實時定量PCR 檢測Rank、Cathepsin K、NFATc1、Gα13（表1）。

表1 qPCR的引物序列

六、破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的分析

BMMs 細(xì)胞接種于6 孔板（50×104個/孔），實驗分組同上，RANKL 誘導(dǎo)和淫羊藿苷干預(yù)5 d 后，裂解細(xì)胞，提取全蛋白，各組蛋白等量上樣后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，275 mA 恒流轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，4 ℃孵育一抗，過夜，室溫孵育二抗1 h，TBST 漂洗條帶后在曝光機(jī)上顯影。檢測Gα13 蛋白、破骨細(xì)胞特異標(biāo)志蛋白TRAF6 及 相關(guān)信號通 路 蛋 白AKT、NFATc1 的 表達(dá)。GADPH作內(nèi)參。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0（IBM 公司，美國）統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析檢驗，兩樣本比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、淫羊藿苷抑制破骨細(xì)胞的生成

TRAP 染色結(jié)果顯示，與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L組相比，給予不同濃度的淫羊藿苷干預(yù)后，破骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且成濃度賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1，P＜0.05）。

圖1 淫羊藿苷干預(yù)后TRAP染色結(jié)果 a：對照組；b：0 μmol/L組；c：1 μmol/L組；d：10 μmol/L組；e：TRAP陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計圖（與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L組比較，*P＜0.05）

鬼筆環(huán)肽和DAPI染色同樣顯示，與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L 組相比，淫羊藿苷干預(yù)組顯著抑制F-actin 環(huán)形成，且呈濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2，P＜0.05）。上述結(jié)果表明淫羊藿苷可顯著抑制破骨細(xì)胞形成。

圖2 淫羊藿苷顯著抑制破骨細(xì)胞F-actin環(huán)數(shù)目 a：鬼筆環(huán)肽和DAPI染色結(jié)果；b：破骨細(xì)胞F-actin環(huán)形成數(shù)目（與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L組比較，*P＜0.05）

二、淫羊藿苷促進(jìn)Gα13 基因的表達(dá)，抑制相關(guān)通路基因的表達(dá)

實時定量PCR檢測結(jié)果表明，與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L 組相比，淫羊藿苷干預(yù)的各組中Gα13 基因的表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L組相比，淫羊藿苷干預(yù)組中有Akt-GSK3β-NFATc1信號通路的NFATc1 基因和破骨細(xì)胞特異性基因Rank、Cathepsin K 的表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 淫羊藿苷促進(jìn)Gα13基因的表達(dá)，抑制其下游Akt-GSK3β-NFATc1相關(guān)通路基因的表達(dá)（與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L 組比較，*P＜0.05）

三、淫羊藿苷促進(jìn)Gα13 蛋白的表達(dá)，抑制Akt-GSK3β-NFATc1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況顯示，與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L 組相比，淫羊藿苷干預(yù)組的Gα13 蛋白表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。淫羊藿苷抑制Akt-GSK3β-NFATc1信號通路相關(guān)蛋白Akt、NFATc1及破骨細(xì)胞特異標(biāo)志蛋白TRAF6 的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 淫羊藿苷促進(jìn)Gα13蛋白的表達(dá)，抑制Akt-GSK3β-NFATc1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) a：淫羊藿苷干預(yù)后各蛋白條帶；b：淫羊藿苷干預(yù)后各蛋白相對表達(dá)量（與未加淫羊藿苷干預(yù)的0 μmol/L組比較，*P＜0.05）

討 論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種以骨質(zhì)量、骨強(qiáng)度和骨微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)性損壞為特征的代謝性疾病，給社會經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重威脅［14］。一些研究表明，骨質(zhì)疏松癥是由過度異常的破骨細(xì)胞活動引起的病理性骨吸收［15-17］。骨吸收增加表明破骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，因此，抑制破骨細(xì)胞的異常形成和激活可能是治療骨質(zhì)疏松癥有效的策略之一［18］。

中藥淫羊藿常用于治療骨質(zhì)疏松癥，淫羊藿苷是淫羊藿中含量最豐富的類黃酮成分，對骨質(zhì)疏松癥、骨折愈合和關(guān)節(jié)疾病均有療效［19］。研究報道，淫羊藿苷有多種生物活性，包括促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制破骨細(xì)胞形成、防止骨丟失［20］。淫羊藿苷通過調(diào)節(jié)許多破骨細(xì)胞形成的正調(diào)節(jié)信號通路已經(jīng)被報道，如淫羊藿苷通過調(diào)節(jié)NF-κB 和MAPK 等通路來抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成［10，21］，但通過調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)節(jié)通路與負(fù)調(diào)節(jié)因子來抑制破骨細(xì)胞生成的研究較少。

Gα13屬于G蛋白超家族的G12亞家族，是一種內(nèi)源性破骨細(xì)胞的負(fù)調(diào)控因子，可通過調(diào)節(jié)Rho-GEF-RhoGTPase 信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織、線粒體功能，還可通過調(diào)節(jié)RhoA 因子的活化、Akt-GSK3β-NFATc1信號通路等多種途徑抑制破骨細(xì)胞形成［22-23］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿苷干預(yù)后，破骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少，破骨細(xì)胞相關(guān)基因RANK 和相關(guān)蛋白TRAF6 表達(dá)量明顯降低，表明淫羊藿苷可明顯抑制破骨細(xì)胞生成，抑制作用與淫羊藿苷濃度正相關(guān)。淫羊藿苷處理后，Gα13基因及蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，其下游Akt-GSK3β-NFATc1 信號通路中Akt、NFATc1基因及蛋白量顯著下降。上述結(jié)果表明Gα13可能參與了調(diào)控淫羊藿苷抑制破骨細(xì)胞形成的相關(guān)通路。

綜上所述，Gα13可能參與了調(diào)控淫羊藿苷抑制破骨細(xì)胞形成的相關(guān)通路，淫羊藿苷可能通過促進(jìn)負(fù)調(diào)控因子Gα13的表達(dá)，從而抑制其下游Akt-GSK3β-NFATc1信號通路來抑制破骨細(xì)胞形成。本研究就淫羊藿苷對破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的思路和參考。