郭曉娟，王金西，牛廣旭，田云霄，*

(1．邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北 邯鄲056001；2．邯鄲市第一醫(yī)院普外四科，河北邯鄲 056002)

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥，其發(fā)病率、死亡率在不斷上升，而我國女性乳腺癌發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)均居世界首位，分別占世界女性乳腺癌發(fā)病和死亡人數(shù)的17.6%和15.6%[1]。不同區(qū)域乳腺癌發(fā)病率、死亡率及分子類型存在差異[2]，乳腺癌中約70%～80%為浸潤性導(dǎo)管癌(invasive ductal carcinoma，IDC)。根據(jù)2019圣加倫(St.Gallen)乳腺癌國際共識，采用免疫組化檢測替代基因表達(dá)譜分析，可將浸潤性乳腺癌(invasive breast carcinoma，IBC)分為Luminal A型、Luminal B型、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)過表達(dá)型及基底樣乳腺癌(basal-like breast carcinoma，BLBC)。BLBC是三陰型乳腺癌(triple negative breast carcinoma，TNBC)的一種亞型。人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factorreceptor，EGFR)家族屬于酪氨酸激酶Ⅰ亞族的跨膜蛋白受體，包括EGFR(HER-1/erbB1)、HER-2(erbB2)、HER-3(erbB3)和HER-4(erbB4)[3]，其中EGFR和HER-2最常見于人類腫瘤發(fā)生過程中。目前研究證實(shí)，EGFR和HER-2可在多種人類惡性腫瘤中過度表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)[4]，并且是目前國際公認(rèn)的重要治療靶點(diǎn)。但二者之間是否存在某種關(guān)系，研究甚少。本文回顧性收集邯鄲市中心醫(yī)院650例乳腺癌患者標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化方法檢測EGFR、HER-2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，采用χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)EGFR、HER-2陽性率在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌顯著升高，且EGFR陽性率與HER-2的評分等級及陽性表達(dá)均呈正相關(guān)，EGFR在HER-2過表達(dá)型與三陰型乳腺癌組織中顯著升高，為研究HER-2陽性乳腺癌及三陰型乳腺癌的靶向藥物治療提供線索及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2015年1月—2020年3月邯鄲市中心醫(yī)院住院行乳腺癌根治切除術(shù)或乳腺癌單切術(shù)標(biāo)本650例，病例篩選納入標(biāo)準(zhǔn)：女性患者；患者臨床資料、病理診斷結(jié)果、免疫組化檢測結(jié)果、隨訪治療完整；術(shù)前未進(jìn)行放療、化療、內(nèi)分泌等任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：男性患者；臨床資料不完整；未行免疫組化檢測；HER-2評分可疑陽性未進(jìn)一步行FISH檢測。650例乳腺癌患者中，IDC 600例，浸潤性小葉癌50例。對照病例選取同期手術(shù)切除的乳腺纖維腺瘤的標(biāo)本30例，要求腫物完整切除不伴有其他乳腺疾病，患者資料完整?；颊呋蚣覍偻鈪⑴c研究并簽署知情同意書。本次研究得到邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方 法

所有標(biāo)本經(jīng)4%中性福爾馬林固定18～24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片4μm厚，蘇木精-伊紅染色法(HE染色)。采用SP法行免疫組織化學(xué)檢測，一抗EGFR、HER-2、雌激素(estrogen，ER)、孕激素(progesterone，PR)、增殖指數(shù)(Ki67)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)分析及結(jié)果評價

1.3.1 HER-2蛋白采用DAKO Hercept Test評分系統(tǒng)評價HER-2蛋白表達(dá)水平，表達(dá)于細(xì)胞膜，評級為(0)～(3+)。陰性(0)：無染色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱細(xì)胞膜染色；(1+)：＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色?？梢申栃?2+)：＞10%浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度的、完整細(xì)胞膜染色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染；陽性(3+)：＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈強(qiáng)、完整、均勻的細(xì)胞膜染色。

1.3.2 EGFR蛋白根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量及著色程度進(jìn)行半定量分析，EGFR主要定位于細(xì)胞膜，陽性細(xì)胞數(shù)量：陽性細(xì)胞數(shù)＜1%，計(jì)0分；1%≤陽性細(xì)胞數(shù)≤30%，計(jì)1分；30%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤70%，計(jì)2分；70%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤100%，計(jì)3分；著色程度：0分為不著色；1分為淺棕色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)累計(jì)相加：＜3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)[5]。ER、PR、Ki67均定位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞數(shù)與腫瘤細(xì)胞數(shù)的比例即為陽性率(%)。

1.4 熒光原位雜交檢測HER-2基因擴(kuò)增情況

免疫組化染色HER-2可疑陽性的病例需進(jìn)一步行熒光原位雜交(fluorescentin situhybridization，F(xiàn)ISH)檢測明確HER-2基因是否擴(kuò)增。在腫瘤區(qū)域清晰處，計(jì)數(shù)至少20個細(xì)胞核內(nèi)GSP HER-2(紅色)和CEPl7(綠色)信號。分別記錄紅色和綠色的信號總數(shù)，計(jì)算平均每個細(xì)胞GSP HER-2、CEPl7拷貝數(shù)及兩者的比值。HER-2/CEPl7＜2.0，且平均GSP HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)＜4.0，為HER-2陰性(無基因擴(kuò)增)；HER-2/CEPl7＜2.0，且4.0≤平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)＜6.0，為不確定HER-2基因是否擴(kuò)增；HER-2陽性且HER-2/CEPl7≥2.0，或HER-2/CEPl7＜2.0而平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥6，為HER-2基因擴(kuò)增。

1.5 分子分型定義

按St.Gallen乳腺癌國際共識，依據(jù)ER、PR、HER-2、Ki67表達(dá)情況進(jìn)行分型。Luminal A型：ER且PR陽性，HER-2陰性以及Ki67≤14%。Luminal B型：ER陽性，HER-2陰性以及Ki67＞14%，或Ki67中間型、PR陰性或低表達(dá)(＜20%)；ER陽性，HER-2陽性或擴(kuò)增，任何Ki67或任何PR。HER-2過表達(dá)型：HER-2陽性或擴(kuò)增，且ER與PR陰性。三陰型：ER、PR和HER-2均陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(n)或率(%)表示，組與組之間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson積矩及Spearman秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、HER-2蛋白在不同乳腺病變中的表達(dá)情況

本研究納入IDC 600例，其中EGFR蛋白表達(dá)陽性292例(48.7%)；HER-2表達(dá)陽性167例(27.8%)，其中包括HER-2蛋白表達(dá)陽性149例、HER-2基因擴(kuò)增18例。浸潤性小葉癌50例，其中EGFR蛋白表達(dá)陽性12例(24.0%)，HER-2蛋白表達(dá)陽性4例(8.0%)。對照組乳腺纖維腺瘤30例，EGFR蛋白表達(dá)陽性5例(16.7%)，HER-2蛋白表達(dá)陽性2例(6.7%)。各組之間兩兩比較，EGFR、HER-2在IDC中表達(dá)陽性率顯著高于浸潤性小葉癌與纖維腺瘤(P＜0.05)，在浸潤性小葉癌與纖維腺瘤中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。

表1 EGFR、HER-2在浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌、纖維腺瘤中的表達(dá)情況

2.2 浸潤性導(dǎo)管癌中EGFR、HER-2蛋白表達(dá)情況及其相關(guān)性

600例IDC中HER-2評分為0者58例(9.7%)，其中12例EGFR陽性(20.7%)；評分(1+)病例數(shù)261例(43.5%)，其中72例EGFR陽性(27.6%)；評分(2+)病例數(shù)132例(22.0%)，其中78例EGFR陽性(59.1%)；評分(3+)病例數(shù)149例(24.8%)，其中130例EGFR陽性(87.2%)。見圖1。132例HER-2評分(2+)均進(jìn)行FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增情況，其中18例擴(kuò)增陽性，檢測陽性率為13.6%。見圖2。EGFR陽性率隨HER-2評分等級增高而逐漸升高，采用Spearman秩相關(guān)分析，提示EGFR陽性率同HER-2評分等級呈正相關(guān)(r=1.000，P＜0.05)。見表2。

圖1 EGFR、HER-2蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果評價示例（SP法，×200）

圖2 FISH檢測顯示HER-2基因擴(kuò)增1 000倍

表2 600例IDC中EGFR、HER-2表達(dá)情況及其相關(guān)性

2.3 浸潤性小葉癌中EGFR、HER-2蛋白表達(dá)情況及其相關(guān)性

50例浸潤性小葉癌中HER-2評分為0者7例(14.0%)；評分(1+)的病例數(shù)為31例(62.0%)，其中5例FGER陽性(16.1%)；評分(2+)的病例數(shù)為8例(16.0%)，其中4例EGFR陽性(50.0%)；評分(3+)的病例數(shù)為4例(8.0%)，其中3例EGFR陽性(75.0%)。8例HER-2評分(2+)者中，F(xiàn)ISH檢側(cè)HER-2基因擴(kuò)增者0例。EGFR陽性率隨HER-2評分等級增高而逐漸升高，采用Spearman秩相關(guān)分析，提示EGFR陽性率同HER-2評分等級呈正相關(guān)(r=1.000，P＜0.05)。見表3。

表3 50例浸潤性小葉癌中EGFR、HER-2蛋白表達(dá)情況及其相關(guān)性

2.4 浸潤性乳腺癌中EGFR、HER-2表達(dá)的相關(guān)性

650例浸潤性乳腺癌中，EGFR蛋白表達(dá)陽性總數(shù)304例(46.8%)，HER-2蛋白表達(dá)陽性總數(shù)171例(26.3%)，171例HER-2蛋白表達(dá)陽性組中EGFR蛋白表達(dá)陽性151例，479例HER-2蛋白表達(dá)陰性組中EGFR蛋白表達(dá)陽性153例，采用Pearson積矩相關(guān)分析，提示EGFR蛋白表達(dá)與HER-2蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.209，P＜0.05)。

2.5 浸潤性乳腺癌中各分子亞型中EGFR蛋白表達(dá)情況

依據(jù)ER、PR、HER-2及Ki-67的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分子分型，650例浸潤性乳腺癌中Luminal A型166例(25.5%)；Luminal B型總數(shù)290例(44.6%)，其中Luminal B(HER-2陰性)型221例(34.0%)，Luminal B(HER-2陽性)型69例(10.6%)；HER-2過表達(dá)型102例(15.7%)；三陰型92例(14.2%)。各組分別對應(yīng)EGFR陽性數(shù)35例(21.1%)、110例(37.9%)、53例(24.0%)、57例(82.6%)、93例(91.2%)、66例(71.7%)。Luminal B型病例數(shù)明顯多于其他3型，Luminal A型明顯多于HER-2過表達(dá)型及三陰型，Luminal B(HER2陰性)型明顯多于Luminal B(HER2陽性)型。EGFR陽性率在HER-2過表達(dá)型和三陰型中顯著高于Luminal A型和Luminal B型，Luminal B型中HER-2陽性型明顯高于HER-2陰性型(P＜0.01)，其他指標(biāo)的組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 650例IBC各分子亞型分布情況及EGFR表達(dá)情況

3 討論

EGFR是一種跨膜蛋白受體，由erbB1基因編碼，其位于人第7號染色體短臂上(7p12)，全長約118 kb，由28個外顯子組成?，F(xiàn)有的研究表明EGFR相關(guān)信號通路在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。EGFR酪氨酸激酶抑制劑是目前針對EGFR治療非小細(xì)胞肺癌的重要分子靶向藥。多項(xiàng)研究顯示EGFR在結(jié)直腸癌、鼻咽癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌、膽管癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，參與了腫瘤血管的生成、轉(zhuǎn)移、黏附，并抑制了細(xì)胞凋亡等過程，并且與患者的預(yù)后和總生存期密切相關(guān)[5-6]。一項(xiàng)研究結(jié)直腸癌CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)腫瘤靶點(diǎn)的篩選中，發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞可以大量殺死EGFR陽性的腫瘤細(xì)胞，認(rèn)為EGFR為CAR-T細(xì)胞免疫療法的靶點(diǎn)[7]。以EGFR為靶點(diǎn)治療腫瘤的研究越來越多。宋欣等[8]采用免疫組化與熒光原位雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，EGFR和HER-2在肺癌和乳腺癌中的蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增具有同樣的變化趨勢，EGFR和HER-2蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增之間均存在正相關(guān)性。由此，我們通過EGFR、HER-2免疫組化檢測結(jié)果陽性來判斷存在基因擴(kuò)增的可能性大。我們的研究數(shù)據(jù)顯示EGFR在IDC中表達(dá)明顯高于浸潤性小葉癌及乳腺纖維腺瘤，提示EGFR的高表達(dá)與IDC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這為我們將來研究針對EGFR為靶點(diǎn)治療乳腺癌提供了線索。

2011年的研究統(tǒng)計(jì)138例乳腺癌，其中EGFR表達(dá)與HER-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[9]，而本研究統(tǒng)計(jì)的650例乳腺癌數(shù)據(jù)中顯示EGFR的表達(dá)隨著HER-2的表達(dá)強(qiáng)度增加而升高，且EGFR的表達(dá)陽性率與HER-2陽性表達(dá)呈正相關(guān)。HER-2與ERFG同屬于酪氨酸激酶受體家族成員，具有高度同源性。至今未找到HER-2的特異性配體，在其它家族成員的配基作用下，可與同家族成員EGFR結(jié)合形成同源性二聚體，引起HER-2羧基末端酪氨酸殘基磷酸化，之后，激活其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)Ras-Raf-MEK-MAPK通路與PI3K-Akt激酶通路，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附、轉(zhuǎn)化、存活、凋亡等過程[10]。另有研究顯示HER-2可阻斷EGFR的內(nèi)化降解，致使EGFR表達(dá)水平升高[11]。這些理論可以解釋本研究的結(jié)果，且已有研究報(bào)道呈現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)相同的結(jié)果[12]。楊悅等[13]研究EGFR、HER-2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義時，發(fā)現(xiàn)EGFR陽性組中HER-2陽性率明顯高于EGFR陰性組，提示二者在結(jié)直腸癌中有共表達(dá)現(xiàn)象。在胃癌的研究中亦是如此[14]。目前，針對HER-2靶點(diǎn)的乳腺癌藥物曲妥珠單抗在臨床中取得了一定成效，成為HER-2陽性乳腺癌患者首選靶向藥物，盡管如此，臨床上出現(xiàn)曲妥珠單抗耐藥，導(dǎo)致部分患者的治療無效，普遍耐藥性成為臨床靶向治療的巨大挑戰(zhàn)，因此研究聯(lián)合用藥的成為新需求。早有報(bào)道，HER-2/EGFR雙受體酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼可以在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞活性，且臨床研究顯示，可以治療侵襲、復(fù)發(fā)、炎性、腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌，并展望拉帕替尼能成為HER-2過表達(dá)乳腺癌的一線輔助或解救治療藥物，同時拉帕替尼治療其他實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)也在大規(guī)模的開展，不斷報(bào)道拉帕替尼在臨床中取得了較好的療效[15]。在研究HER-2/EGFR雙重抑制作用的小分子抑制劑時，發(fā)現(xiàn)同時針對HER-2和EGFR兩個靶點(diǎn)，可以抑制多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，避免單一信號通路抑制的代償，從而降低耐藥性和不良反應(yīng)，進(jìn)一步構(gòu)建了一種靶向HER-2/EGFR分子雙特異性單鏈抗體，并在體內(nèi)外抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的活性和增殖[16]。

我們統(tǒng)計(jì)的650例浸潤性乳腺癌中Luminal A型166例(25.5%)；Luminal B型總數(shù)290例(44.6%)，其中Luminal B(HER-2陰性)型221例(34.0%)，Luminal B(HER-2陽性)型69例(10.6%)；HER-2過表達(dá)型102例(15.7%)；三陰型92例(14.2%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ishitha等[17]的研究結(jié)果相比，Luminal B(HER-2陰性)型比例偏高，三陰型略偏低，Luminal A型、Luminal B(HER-2陽性)型、HER-2過表達(dá)型比例基本保持一致。乳腺癌在不同區(qū)域，其分子亞型可以出現(xiàn)差異[2]。EGFR在HER-2過表達(dá)型、Luminal B(HER-2陽性)的陽性率顯著高于Luminal A型及Luminal B(HER-2陰性)，這可以用EGFR表達(dá)與HER-2表達(dá)呈正相關(guān)來解釋。EGFR陽性率在HER-2過表達(dá)型和三陰型中顯著高于Luminal A型和Luminal B型，這同李星枝等[18]的研究結(jié)果保持一致。三陰型乳腺癌具有非常特殊的生物學(xué)行為和臨床病理特征，被認(rèn)為是一種獨(dú)立的臨床病理類型，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，由于ER、PR、HER-2均為陰性，因此難以從內(nèi)分泌治療中獲益，同時對常規(guī)化療不敏感，HER-2靶向藥物治療無效，尋找其有效的治療方案是近幾年研究的熱點(diǎn)之一。EGFR靶向藥物的研究及在臨床治療多種腫瘤中取得一定療效，其成為我們關(guān)注的熱點(diǎn)[19-20]。EGFR在三陰型乳腺癌中陽性率顯著升高，提示EGFR靶向藥物治療三陰型乳腺患者的可能性。

綜上所述，EGFR在浸潤性乳腺癌中表達(dá)陽性率升高，且與HER-2表達(dá)呈正相關(guān)，在HER-2過表達(dá)型，三陰型乳腺癌中的高表達(dá)，為我們研究HER-2/EGFR雙重抑制劑治療HER-2陽性乳腺癌及EGRF靶向藥物治療三陰型乳腺癌的可能性提供了線索和依據(jù)。