李若楠，劉怡文，楊 洪，孔金玉，孫 蔚，高社干

1)河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 河南洛陽 471000 2)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院；河南科技大學(xué)腫瘤研究所；河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽 471003 3)河南科技大學(xué)信息工程學(xué)院 河南洛陽 471003 4)河南科技大學(xué)體育學(xué)院 河南洛陽 471003

食管癌發(fā)病率與死亡率高，早期多表現(xiàn)為消化系統(tǒng)疾病的一般癥狀，易被忽略，確診時(shí)多發(fā)展至晚期，5 a生存率低于20%[1]。作者在前期研究[2]中發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)在上消化道腫瘤中呈上高下低的分布且與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其具體致病機(jī)制尚不完全明確。研究[3]顯示，多種病原微生物均能通過調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白重塑腫瘤微環(huán)境，為自身長(zhǎng)期定植提供有利條件。程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death factor 4，PDCD4)是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過阻止蛋白質(zhì)翻譯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且PDCD4下調(diào)或缺乏可使腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)干性增強(qiáng)[4]。CSC是存在于腫瘤中具有高度自我更新和異常分化潛能的一小部分細(xì)胞亞群[5]。盡管傳統(tǒng)放化療對(duì)腫瘤有一定的治療效果，但臨床數(shù)據(jù)顯示CSC對(duì)各種治療均具有抗性，CSC已被認(rèn)為是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[6]。目前已證實(shí)乙醛脫氫酶1(acetaldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)是食管癌優(yōu)選的干細(xì)胞標(biāo)記物[7]。

本研究首先建立PDCD4敲降的食管癌細(xì)胞系，分別用Pg感染親本與敲降細(xì)胞，探討Pg與PDCD4在食管癌紫杉醇(paclitaxel，PTX)化療抵抗中的作用及可能的分子機(jī)制，為食管癌的臨床治療提供新思路和治療手段。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑與儀器人食管癌KYSE30細(xì)胞系及293T細(xì)胞系(上海弘順生物科技有限公司)。4～6周齡健康SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠，體重約20 g(中國(guó)常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010。Pg菌株ATCC 33277(美國(guó)路易斯維爾大學(xué)口腔生物實(shí)驗(yàn)室捐贈(zèng))。GAM肉湯培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)5%脫脂綿羊血、氯化血紅素和維生素K(中國(guó)索萊寶公司)，RPMI 1640、opti-MEM及DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，慢病毒包裝試劑盒(GeneCopeia公司)，PTX(美國(guó)Selleck Chemicals公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)，ALDEFLUORTM干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(加拿大Stemcell Technologies公司)，PKH67細(xì)胞熒光標(biāo)記試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，PDCD4、ALDH1和內(nèi)參GAPDH抗體(美國(guó)Abcam公司)，二抗和BCA蛋白定量試劑盒(中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司)，PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，ECL發(fā)光顯影液(美國(guó)Invitrogen公司)。凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)，PE小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)(美國(guó)珀金埃爾默公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)，厭氧工作站(美國(guó)COY公司)。

1.2 PDCD4敲降KYSE30細(xì)胞系的建立293T細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(56 ℃熱滅活30 min)的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至密度達(dá)60%～70%。由GeneCopeia公司設(shè)計(jì)PDCD4敲降質(zhì)粒(PDCD4-DNA)，根據(jù)慢病毒包裝試劑盒說明配制PDCD4-DNA-EndoFectin 混合物,室溫中放置30 min后，將混合物加入293T細(xì)胞中,常規(guī)培養(yǎng)12 h更換為新鮮培養(yǎng)基，加入滴度增強(qiáng)劑。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收取病毒上清，用0.45 μm濾器過濾。待KYSE30細(xì)胞密度至50%～60%時(shí)，加入病毒上清，用嘌呤霉素篩選培養(yǎng)2周。提取細(xì)胞蛋白，通過Western blot法檢測(cè)PDCD4表達(dá)水平，評(píng)估敲降效率。將PDCD4敲降后的細(xì)胞命名為KYSE30-P。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組Pg菌株用含體積分?jǐn)?shù)5%脫脂綿羊血、10 g/L氯化血紅素和10 g/L維生素K的GAM肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)85%N2、10%H2和5%CO2厭氧工作站中常規(guī)培養(yǎng)。利用革蘭染色法及哥倫比亞血瓊脂板檢測(cè)Pg的純度。選取活力較好的Pg菌液(OD600 nm=1～2)，待KYSE30或KYSE30-P細(xì)胞密度為 60%～70%時(shí)，按感染復(fù)數(shù)MOI=10將Pg加入細(xì)胞培養(yǎng)基，感染時(shí)間為24 h，將Pg感染后的細(xì)胞命名為KYSE30+Pg與KYSE30-P+Pg，未感染細(xì)胞KYSE30和KYSE30-P為對(duì)照。

1.4 4組細(xì)胞PTXIC50的檢測(cè)采用CCK-8法檢測(cè)KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg及KYSE30-P+Pg細(xì)胞PTX作用24 h的IC50。取96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，約1 000個(gè)細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)24 h。每組細(xì)胞均用不同濃度的PTX(從0 mg/L開始，每增加0.5 mg/L設(shè)置1個(gè)濃度，直至30.0 mg/L)培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，1 h后酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm，計(jì)算IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 4組細(xì)胞中PDCD4及ALDH1蛋白表達(dá)的檢測(cè)提取KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg及KYSE30-P+Pg組細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度并定量。每泳道上樣量30 μg總蛋白，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含50 g/L 脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，TBST洗膜后，加入一抗PDCD4、ALDH1(1∶1 000 稀釋)和內(nèi)參GAPDH(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h。TBST洗膜后，ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并應(yīng)用Image Lab軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 4組細(xì)胞中CSC百分比的檢測(cè)用ALDEFLUORTM檢測(cè)緩沖液將4組細(xì)胞(KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg及KYSE30-P+Pg)的密度均調(diào)整至1×106個(gè)/mL。每組抽取1 mL細(xì)胞懸液放入檢測(cè)管中，對(duì)照管中加入5 μL二乙氨基苯甲醛試劑。檢測(cè)管中加入5 μL活化的ALDEFLUORTM試劑混合均勻，并立即抽取0.5 mL混合物加入對(duì)照管中。37 ℃孵育30 ～ 60 min。250×g離心5 min，棄上清。用0.5 mL ALDEFLUORTM檢測(cè)緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)ALDH1標(biāo)記的陽性細(xì)胞(CSC)。以檢測(cè)管與對(duì)照管中CSC百分比的差值為最終CSC百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)24只BALB/c裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：KYSE30組、KYSE30-P組、KYSE30+Pg組與KYSE30-P+Pg組，每組6只。用PKH67熒光標(biāo)記KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg與KYSE30-P+Pg細(xì)胞。裸鼠皮膚消毒后，按分組于每只裸鼠右側(cè)腋下接種標(biāo)記后的細(xì)胞5×106個(gè)。接種后2周，各組裸鼠皮下腫瘤長(zhǎng)至直徑0.5～1.0 cm。之后每3 d尾靜脈注射一次PTX，劑量為10 mg/kg，共給藥6次[8]。最后一次給藥后3 d用小動(dòng)物活體成像儀拍攝并測(cè)量腫瘤大小，然后用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，頸椎離斷法處死，剝離瘤體稱重。一部分瘤體用于檢測(cè)PDCD4及ALDH1蛋白的表達(dá)情況，另一部分研磨后配制成單細(xì)胞懸液，用于檢測(cè)CSC百分比，方法同前。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 23.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較KYSE30細(xì)胞與KYSE30-P細(xì)胞中PDCD4表達(dá)量的差異。采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析探討PDCD4敲降或Pg感染對(duì)KYSE30細(xì)胞中PDCD4蛋白、ALDH1蛋白、CSC百分比及PTXIC50的影響，以及PDCD4敲降或Pg感染對(duì)裸鼠PTX化療敏感性、成瘤能力及裸鼠瘤體組織PDCD4、ALDH1蛋白及CSC百分比的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4敲降的KYSE30細(xì)胞系的建立采用PDCD4-DNA敲降質(zhì)粒及慢病毒包裝試劑盒構(gòu)建PDCD4敲降的KYSE30細(xì)胞系，結(jié)果(圖1、表1)顯示，與KYSE30細(xì)胞(1.61±0.07)相比，KYSE30-P細(xì)胞中PDCD4表達(dá)量(0.17±0.02)降低(t=19.331，P=0.001)，表明成功建立PDCD4敲降的KYSE30-P細(xì)胞系。

2.2 Pg感染及PDCD4敲降對(duì)KYSE30細(xì)胞PDCD4、ALDH1蛋白表達(dá)，CSC百分比及PTXIC50的影響Pg感染與PDCD4敲降均可降低KYSE30細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)量，升高ALDH1蛋白表達(dá)量、CSC百分比及PTXIC50，且Pg感染與PDCD4敲降存在協(xié)同作用(圖2、表1)。

1：KYSE30細(xì)胞；2：KYSE30-P細(xì)胞

1～4：分別為KYSE30組、KYSE30-P組、KYSE30+Pg組、KYSE30-P+Pg組

表1 4組細(xì)胞中PDCD4蛋白、ALDH1蛋白、CSC百分比及PTX IC50的比較

2.3 Pg感染及PDCD4敲降對(duì)裸鼠PTX治療效果的影響結(jié)果(圖3、表2)顯示：Pg感染與PDCD4敲降均可降低裸鼠瘤體對(duì)PTX敏感性，增強(qiáng)成瘤能力，且二者存在協(xié)同作用。

圖3 活體成像檢測(cè)各組裸鼠瘤體大小及熒光強(qiáng)度

表2 各組裸鼠瘤體熒光強(qiáng)度及質(zhì)量的比較

2.4 Pg感染及PDCD4敲降對(duì)裸鼠瘤體內(nèi)PDCD4、ALDH1蛋白表達(dá)及CSC百分比的影響結(jié)果(圖4、表3)顯示：Pg感染與PDCD4敲降均可降低裸鼠瘤體內(nèi)PDCD4蛋白表達(dá)量，升高ALDH1蛋白表達(dá)量及CSC百分比，且二者存在協(xié)同作用。

1～4：分別為KYSE30組、KYSE30-P組、KYSE30+Pg組、KYSE30-P+Pg組

表3 各組裸鼠瘤體內(nèi)PDCD4、ALDH1蛋白及CSC百分比的比較

3 討論

化療對(duì)于中晚期食管癌患者至關(guān)重要，其中PTX已被證實(shí)為反應(yīng)良好的化療藥物之一，但易產(chǎn)生耐藥[9]。因此，尋找食管癌PTX耐藥的分子機(jī)制對(duì)于改進(jìn)食管癌治療方法、提高臨床療效具有極其重要的意義。我們前期研究[10]證實(shí)Pg可長(zhǎng)期定植于食管癌組織，促進(jìn)其惡性進(jìn)展，且Pg感染陽性的食管癌患者PTX化療效果并不理想，但其具體機(jī)制尚不完全明確。

研究[11]顯示，多種病原微生物均能通過調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞惡性增殖能力，降低其對(duì)化療藥物的敏感性。如幽門螺桿菌可通過抑制PDCD4表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)其侵襲能力及抗凋亡能力；HPV可通過抑制宮頸癌細(xì)胞PDCD4活性，阻斷癌細(xì)胞程序性凋亡，促進(jìn)其惡性增殖[12]；EB病毒可通過降低PDCD4活性，抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡，協(xié)助其順鉑化療抵抗[13]。PDCD4是細(xì)胞凋亡過程中至關(guān)重要的抑癌基因，可與真核細(xì)胞翻譯起始因子偶聯(lián)，抑制核糖體復(fù)合物形成，阻止蛋白質(zhì)翻譯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。資料[14]顯示，食管癌、胃癌、肝癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中PDCD4表達(dá)均下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，Pg感染與PDCD4敲降均可引起KYSE30細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)降低及PTXIC50增高，提示Pg感染可抑制KYSE30中PDCD4表達(dá)，而PDCD4低表達(dá)可削弱KYSE30對(duì)PTX的敏感性；PDCD4可能為Pg感染引起的PTX化療抵抗中的關(guān)鍵負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。

此外，PDCD4表達(dá)下調(diào)與CSC干性的維持密切相關(guān)[15]。PDCD4表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)肝臟CSC遷徙和轉(zhuǎn)移[16]。PDCD4缺乏可導(dǎo)致脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)的干性增強(qiáng)，促進(jìn)ADSC的增殖和集落形成能力[17]。目前的治療手段(放、化療)主要針對(duì)已分化的細(xì)胞，但恰恰這些數(shù)量極少的CSC決定了惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及對(duì)治療的敏感性[18]。CSC的檢測(cè)與分選已成為腫瘤治療的關(guān)鍵。ALDH1是一種將醛類氧化成羧酸類的依賴煙酰型輔酶的乙醛脫氫酶，具有高度氧化活性，參與基因表達(dá)、組織分化和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等[19]。研究[20]已證實(shí)ALDH1是結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肺癌等多種腫瘤優(yōu)選的CSC標(biāo)志物，且其高表達(dá)與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4敲降或Pg感染均可抑制食管癌細(xì)胞或食管癌裸鼠移植瘤瘤體中PDCD4表達(dá)，促進(jìn)ALDH1蛋白表達(dá)及CSC增多，導(dǎo)致PTX化療抵抗。

綜上所述，Pg感染或PDCD4敲降均可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞中CSC富集及PTX耐藥，且二者聯(lián)用可能具有協(xié)同作用，有效清除Pg并活化PDCD4可能為食管癌的治療提供新策略或手段。